我國市政污水處理廠的日處理規模已超2×108 m3，市政污水的能耗高達2.5GW(按每m3污水處理能耗0.3kWh計算)。污水中蘊含的能量中，約50%以化學能(有機物COD)的形式轉入剩余污泥，因此，回收利用污泥COD的能量對降低市政污水處理行業的能耗和碳排放至關重要。厭氧消化(anaerobicdigestion，AD)是實現污泥減量化、穩定化和能量回收的主流技術之一。目前，我國已建成并運行的市政污泥厭氧消化工程處理規模超9000t∙d-1(按80%含水率的脫水污泥計)，但僅占我國需處理市政污泥總量的7%左右，與英國(75%)、美國(60%)、歐盟國家(30%~50%)的差距明顯。這表明，污泥厭氧消化亟需高效的過程強化(processintensification，PI)技術以提高甲烷產率。
電產甲烷是一種基于微生物電解池(microbialelectrolysiscell，MEC)促進有機物降解和產甲烷的PI技術。在較低的外加電壓條件下，陽極電活性微生物(electroactivebacteria，EAB)氧化分解有機物產生電子、質子和二氧化碳(CO2)，同時，陰極微生物可通過直接或間接電子傳遞的途徑。MEC-AD可加速污泥有機物水解、顯著提高甲烷產率，并實現沼氣生物品位升級，從而與傳統AD工藝相比有較大的技術優勢。在MEC-AD中，陽極EAB與陰極產甲烷古菌通常以氫氣為電子載體或依靠直接胞外電子傳遞機制進行種間電子傳遞。此外，EAB與產甲烷古菌亦可利用具有導電性或氧化還原活性的碳材料，以提高產甲烷過程的種間電子傳遞效率。這些非溶解性的粒狀材料易與微生物形成活性顆粒，能進行厘米級別的遠距離電子傳遞，遠超依靠擴散機制的可溶性電子載體/穿梭體(例如甲酸、核黃素、綠膿素等，電子傳遞距離1~100μm)。
有研究表明，基于生物質中低溫(300~500℃)熱解過程形成的生物炭可通過富含醌基的表面官能團進行電子交換或內部類石墨結構的導電碳層進行直接電子傳遞。YIN等發現，通過在MEC-AD體系中投加適量的污泥基生物炭，污泥揮發性固體(VS)去除率提高了17.9%，甲烷產量提高了24.7%。然而，在更接近實際應用的連續式MEC-AD體系中，投加污泥炭是否具有長期促進效果，以及如何影響體系內微生物群落結構和產甲烷代謝途徑，仍有待進一步探索。
基于上述原因，本研究擬構建并在連續進料運行模式下運行污泥MEC-AD系統，以污泥熱解制備的生物炭為碳材料，研究投加污泥炭對污泥MEC-AD產甲烷的改善情況。在確定了最佳外加電壓之后，考察污泥炭在不同有機負荷條件下對甲烷產率和體系穩定性的提高程度。最后，利用宏基因組手段分析體系內微生物種群結構與特定代謝功能，以揭示污泥炭提高MEC-AD甲烷產率的微生物學機制，為污泥炭強化MEC-AD技術應用于污泥厭氧消化處理工藝提供參考。
1、材料與方法
1.1 供試原料
MEC-AD裝置進料底物為城鎮污水處理廠剩余污泥，取自上海市閔行區水質凈化廠二沉池。污泥取回實驗室后經1mm格篩過濾、高速離心(4000r∙min-1，2min)處理后置于4℃保存備用。MEC-AD接種污泥取自實驗室長期運行的污泥高溫厭氧消化罐。剩余污泥與接種污泥的主要理化性質見表1。
污泥炭由上述剩余污泥熱解制備而成。污泥于105℃烘干48h，球磨至平均粒徑50μm，然后將污泥顆粒干粉置于管式爐中，在無氧條件下熱解1.5h，熱解溫度為500℃，熱解期間始終保持氮氣循環，以保證無氧環境。待冷卻至室溫后，污泥炭在去離子水中浸泡72h，離心過濾后去除上清液以去除有毒有害物質，待105℃烘干24h后置于干燥皿內備用。污泥炭的主要理化性質為，pH7.61、BET比表面積41.8m2∙g-1、總灰分質量分數66.5%。灰分的主要元素質量分數如表2所示，H/C摩爾比與O/C摩爾比分別為0.07與0.11，電子供給能力(EDC)與電子接收能力(EAC)分別達到0.116與0.754meq∙g-1。
1.2 實驗裝置
MEC-AD反應器為單室結構(圖1)，工作體積為1.0L，裝置采用一對碳氈雙電極作為陽極和陰極，電極之間使用銅線連接，電極尺寸為12cm×8cm，電極板間距為1.5cm，供電采用直流穩流穩壓電源(遠方WY3101，杭州)。反應器使用循環水域控溫，采用磁力轉子攪拌以獲得良好的傳質與傳熱。反應器頂部設有1個氣體出口和2個液體進出料口。
1.3 實驗方法
MEC-AD反應器采用連續式運行模式，每24h進行進出料1次，實驗期間溫度和攪拌速率分別為(55±1)℃和100r∙min-1。反應器啟動階段，接種污泥與底物污泥按總固體含量(TS)1∶4的比例加入反應器，初始TS為2.0%。在第一階段實驗中，設有3組反應器，水力停留時間(HRT)為10d，有機負荷率(OLR)為2.5g∙(L∙d)-1，污泥炭的初始投加量為18g∙L-1(劑量0.9g∙g-1)。至沼氣產率趨于穩定后，污泥炭每24h隨進料補充，投加量與初始劑量保持一致。實驗組MEBC0.5和MEBC1.5的外加電壓分別為0.5和1.5V，另設一組無外加電壓的對照組BC。在第2階段實驗中，設有2組反應器，分別是未加污泥炭的對照組ME和投加污泥炭的實驗組MEBC，它們的外加電壓采用第一階段實驗中的最佳電壓。第2階段實驗條件設置如表3所示。運行周期Ⅰ~Ⅲ的HRT分別為10、5和2.5d，進料為剩余污泥。運行周期Ⅳ的HRT恢復至5d；為考察污泥炭對MEC-AD體系穩定性的影響，進料為剩余污泥+甘油混合底物(1∶1基于COD)。
1.4 分析方法
總固體含量(TS)、揮發性固體含量(VS)和化學需氧量(總COD、SCOD)參照《城鎮污水處理廠污泥泥質GB24188-2009》和《水質化學需氧量測定HJ828-2017》。
揮發性脂肪酸使用氣相色譜測定(GC-2010，島津，日本)。1mL沼液經0.45μm膜過濾后與100μL的3%磷酸溶液混合，確保pH<4.0。測試條件為：色譜柱DB-FFAP，FID火焰離子化檢測器，載氣N2流速為30mL∙min-1，進樣口與檢測器溫度分別為200與250℃。
沼氣體積采用排水法測定。保持水溶液pH不超過4.3以防止CO2吸收，沼氣體積數據經標準化(273K，1.01×105 Pa)后記錄。
沼氣成分(CH4、CO2、H2)采用氣相色譜法(GC-7890，安捷倫，美國)測定。測試條件為：色譜柱G3591，TCD熱導檢測器柱箱溫度80℃，載氣He流速為40mL∙min-1，進樣口與檢測器溫度分別為200與250℃。
微生物多樣性和宏基因組學分析。待第二階段實驗周期Ⅲ完成后(70d)，從陰極生物膜上取1mL污泥樣品進行DNA抽提。對DNA剪切后篩選長度為300bp的片段進行建庫。利用PCR擴增進行文庫模板的富集，通過NaOH堿變性產生單鏈DNA片段。隨后進入IlluminaHiseq測序，對測序產生的短讀序列(reads)進行質量剪切后優化序列進行拼裝，篩選>300bp的重疊群(contig)作為最后的拼裝結果，并將核酸長度>100bp的基因翻譯為氨基酸序列。最后，參考NCBI_NR數據庫和KEGG數據庫對比該非冗余基因集序列，分別進行分類和功能注釋。
2、結果與討論
2.1 外加電壓對污泥炭耦合MEC-AD運行效果的影響
外加電壓對MEC-AD反應器運行效果的影響如圖2所示。在反應器運行初期，3組反應器中的SCOD累積濃度均在2d達到峰值(3469mg∙L-1，BC;3858mg∙L-1，MEBC0.5;4066mg∙L-1，MEBC1.5)，之后隨著產酸產甲烷過程的進行在10d后趨于穩定，平均濃度由低到高分別為MEBC1.5<MEBC0.5<BC。這表明高電壓可在促進污泥水解的同時提高可溶性有機物的降解。MEC-AD陽極反應產生的微量氧氣(4H2O→8H++8e-+2CO2)有利于兼養細菌的增殖從而加速有機物的降解轉化。此外，陰極富集的嗜氫產甲烷古菌消耗有機物水解酸化過程中產生的分子氫(H2)，也可促進VFAs的乙酸化過程。MEBC0.5與MEBC1.5的電流密度分別為(1.16±0.29)與(3.83±0.99)A∙m-2。MEBC1.5的消化液pH值略高于MEBC0.5和BC，其原因可能是，高電壓促進了電產甲烷的質子消耗(CO2+8H++8e- →CH4+H2O)。反應器運行期間，MEBC0.5與MEBC1.5的氫分壓顯著高于對照組BC，這表明MEC陰極反應的電子被用于還原質子生成H2，但MEBC實驗組的高氫分壓并未導致酸累積或降低甲烷產率。在反應器穩定運行時期(31~40d)，甲烷產率由高到底分別為MEBC1.5>MEBC0.5>BC。BC、MEBC0.5與MEBC1.5的沼氣甲烷體積分數分別達到65.6%、72.3%與73.9%，外加電壓0.5V和1.5V將沼氣甲烷體積分數提高了10.2%(p<0.05)和12.6%(p<0.01)。這表明MEC生物陰極微生物群可通過氫還原CO2進行沼氣原位品位升級，提高甲烷產量。綜上所述，第一階段的實驗結果表明，外加電壓1.5V的污泥炭耦合MEC-AD運行效果最佳。
2.2 不同有機負荷條件下污泥炭對MEC-AD運行效果的改善
第2階段實驗考察了外加電壓保持1.5V時，不同有機負荷率條件下污泥炭對MEC-AD運行效果的影響，結果如圖3所示。隨著HRT的縮短以及OLR的增加，體系甲烷產率呈現先升高后降低的趨勢。當HRT從10d縮短至5d，ME1.5與MEBC1.5的甲烷產率和相應的沼氣甲烷體積分數分別有顯著提升，這表明投加污泥炭可同時提高MEC-AD體系的甲烷產量并實現原位沼氣品位提升。HRT進一步縮短至2.5d后，ME1.5與MEBC1.5的甲烷產率與周期Ⅱ相比，分別下降了16.7%與22.3%。同時，相應的沼氣甲烷體積分數也降低至73.1%±3.7%與76.5%±4.3%。VFAs質量濃度是反映AD系統穩定度的重要參數，ME1.5與MEBC1.5的總VFAs質量濃度在周期Ⅲ期間上升至(352±107)與(170±46)mg∙L-1，其主要組分為正丁酸、丙酸與乙酸。HO等指出，污泥高溫AD在HRT由3d縮短至2d出現的酸累積和甲烷產量下降主要由產甲烷古菌的洗脫所導致。在本研究中，雖然在HRT=2.5d時觀察到了酸累積現象，但其程度還未引起系統崩潰。由此可見，MEC-AD的碳氈電極表面滯留微生物的能力可有效緩解在短HRT高負荷運行中產甲烷古菌流失的問題。MEC-AD體系內部的電流密度隨著OLR的增加而升高，且在整個污泥消化實驗周期，MEBC1.5的電流密度均顯著高于ME1.5。電流密度的升高可能與多個因素相關，包括陽極氧化反應的有機物降解、EAB菌群的產電活性以及陰極電產甲烷。因此，投加污泥炭可能促進以上的單個或多個代謝過程。此外，在周期Ⅰ~Ⅲ中，污泥炭并未明顯改善沼氣甲烷純度(圖3(a))，但顯著提高了周期Ⅰ與周期Ⅱ的甲烷產率。由于有機物在水解、產酸、產甲烷階段均可能釋放CO2，這表明污泥炭可能同步強化了有機物厭氧降解和乙酸裂解產甲烷過程(CH3COOH→CH4+CO2)，而并非選擇性強化氫還原CO2產甲烷(CO2+H2 →CH4+H2O)。當HRT縮短至2.5d時，ME1.5與MEBC1.5兩組的甲烷產率差異不顯著。這可能與產甲烷古菌的大量流失有關，尤其是乙酸營養型產甲烷古菌(例如甲烷八疊球菌屬Methanosarcina)。
SCOD反映了污泥顆粒性大分子有機物的水解發酵與產甲烷的平衡情況(圖4(a))。在反應器啟動10d后，SCOD的釋放與消耗保持平衡并趨于穩定。在周期Ⅰ~III的穩定期，MEBC1.5的SCOD始終低于ME1.5。這表明污泥炭可促進SCOD的轉化利用，亦與甲烷產率數據的總體趨勢保持一致。MEC-AD系統消化液的pH基本保持在弱堿性范圍(7.4~7.8，圖4(b))，由于剩余污泥具有較高的堿度和較好的緩沖性能，周期Ⅲ的少量酸累積并未引起顯著的pH下降。ME1.5和MEBC1.5的穩定期氫分壓分別為(9.0±3.9)Pa與(4.9±1.8)Pa、(6.8±1.8)Pa與(4.9±1.1)Pa以及(25.3±6.9)Pa與(10.9±3.9)Pa(圖4(c))，在高OLR運行的II~III周期，MEBC1.5的平均氫分壓比ME1.5分別降低了26.0%(p<0.01)與56.9%(p<0.001)。這表明投加污泥炭可顯著促進污泥MEC-AD的氫營養型產甲烷過程，從而強化產氫產乙酸菌-嗜氫產甲烷古菌的互營共生代謝機制。
周期Ⅳ為污泥/甘油共消化的實驗周期。相較于污泥消化的周期Ⅱ，雖然ME1.5與MEBC1.5的甲烷產率分別有小幅提高，但沼氣甲烷體積分數卻有所降低。這主要是因為：甘油無需經過溶胞-水解等限速步驟即可進入發酵產酸階段，期間產生大量CO2，但伴隨而來的酸累積效應可能導致體系不穩定甚至崩潰。基于ME1.5和MEBC1.5的SCOD、VFAs、pH等多個參數的變化情況來看，甘油的快速代謝轉化已引起了體系不穩定，而投加污泥炭可顯著緩解酸累積問題從而維持MEC-AD的運行效果。由厭氧發酵細菌代謝轉化甘油而快速累積的VFAs為互養酸氧化細菌-嗜氫產甲烷古菌等功能菌群提供了豐度的代謝底物，此時MEBC1.5的甲烷產率顯著高于ME1.5(圖3)，從兩實驗組在VFA濃度與氫分壓的顯著差異來看(圖4)，污泥炭的引入提高了VFAs的轉化利用率，并大幅降低了體系氫分壓，從而提高了甲烷產量。
2.3 污泥炭對MEC-AD生物陰極微生物群落結構的影響
生物陰極微生物在基因屬水平和KEGG功能注釋水平上的Venn圖顯示，ME1.5與MEBC1.5陰極微生物在基因水平上和KEGG功能注釋水平上分別共有2587個屬和371個代謝通路，共有率分別為97.3%和97.8%。這表明污泥炭未顯著改變MEC-AD陰極微生物群落的組成和代謝功能(圖5)。ME1.5與MEBC1.5生物陰極細菌組成如圖6所示，優勢門包括Firmicutes、Proteobacteria、Chloroflexi、Synergistetes、Actinobacteria和Thermotogae。在生物陰極細菌屬水平上，投加污泥炭使得優勢菌屬Coprothermobacter、Fervidobacterium、Bellilinea的相對豐度分別顯著增加34.1%、186.6%、130.5%，然而Anaerobaculum的豐度則下降了186.6%。Coprothermobacter是有機質高溫AD系統富集程度較高的菌屬，主要參與蛋白質組分的發酵和產乙酸代謝過程，而Bellilinear則是隸屬于Chloroflexi門的丙酸互營降解產甲烷菌屬。甲烷熱桿菌Methanothermobacter和甲烷八疊球菌Methanosarcina是生物陰極的優勢古菌屬。甲烷熱桿菌為嗜氫產甲烷菌，極易成為生物陰極的優勢產甲烷古菌以利用陰極產生的H2還原CO2生成甲烷。此外，投加污泥炭提高了代謝底物最為廣泛的甲烷八疊球菌的相對豐度，這可能有利于乙酸裂解途徑。
2.4 KEGG代謝通路功能基因分布及產甲烷過程關鍵酶
在兩組生物陰極微生物KEGG代謝通路一級分類中，編碼“CarbonMetabolism”功能的基因豐度最高，分別為67.2%(ME1.5)和68.3%(MEBC1.5)，其次為“GeneticInformationProcessing”、“EnvironmentalInformationProcessing”和“CellularProcesses”。“CarbonMetabolism”類別主要包括“Carbohydratemetabolism”、“Aminoacidmetabolism”、“Energymetabolism”和“Nucleotidemetabolism”，在ME1.5與MEBC1.5中分別為14.6%、10.3%、7.2%、6.4%與15.3%、10.1%、8.3%、5.9%。在本研究中，消化對象為污泥，其主要成分為蛋白質和多糖，因此，其碳水化合物代謝和氨基酸代謝功能基因所占比例較大。在KEGG代謝通路三級分類中，基因豐度差異如圖7所示。生物陰極主要參與Carbonmetabolism、Biosynthesisofaminoacids、Purinemetabolism、Pyrimidinemetabolism、Methanemetabolism、ABCtransporters等過程。相較于對照組ME1.5，投加污泥炭促使MEC-AD陰極微生物實現以上代謝過程的相關基因豐度變化的幅度為+3.1%、-0.5%、+8.0%、+6.8%、+43.1%、-4.5%。以上結果表明，投加污泥炭對于生物陰極產甲烷代謝過程的影響最大(+43.1%)。
在產甲烷過程中，MEC-AD生物陰極微生物表達的酶包括EC6.2.1.1(乙酸-輔酶A連接酶)、EC2.8.4.1(輔酶B-磺乙基巰基轉移酶)、EC1.2.99.5(甲酰甲烷呋喃脫氫酶)、EC2.1.1.86(四氫甲烷蝶呤S-甲基轉移酶)、EC1.12.98.1(輔酶F420)、EC1.8.98.1(甲基吩嗪:CoB-CoM異二硫化物還原酶)。投加污泥炭對MEC-AD產甲烷過程關鍵酶的相關基因豐度影響如表4所示。ME1.5生物陰極的產甲烷過程主要通過H2還原CO2代謝途徑(hydrogenotrophicmethanogenesis，KEGGmoduleM00567)，投加污泥炭同時強化了H2還原CO2途徑和乙酸裂解途徑的產甲烷過程(acetoclasticmethanogenesis，KEGGmoduleM00357)。這與前文2.3節所述的可兼顧氫營養型和乙酸營養型的Methanosarcina菌屬在MEBC1.5中的富集結果一致。污泥炭的投加可促進生物陽極的有機物氧化降解過程，從而提高MEC-AD體系內部電流密度，并通過富集嗜氫產甲烷菌強化了生物陰極電產甲烷過程。鑒于污泥炭本身的弱導電性，它們可能主要通過表面具有氧化還原能力的官能團反復供給、接受電子的機制來強化間接電產甲烷。
3、結論
1)在污泥炭耦合MEC-AD污泥產甲烷體系中，相較于無外加電壓和低電壓(0.5V)，高電壓(1.5V)可促進污泥SCOD釋放與降解速率，提高甲烷產率。
2)在不同有機負荷運行條件下，在HRT為10d與5d的運行周期，投加污泥炭的實驗組MEBC1.5的污泥厭氧消化甲烷產率均顯著高于對照組ME1.5，但當HRT縮短至2.5d，MEBC1.5與ME1.5的甲烷產率并無顯著差異；在污泥-甘油共消化體系中，通過強化產氫產乙酸菌-嗜氫產甲烷古菌的互營共生代謝，污泥炭可有效緩解酸累積抑制，從而可提高甲烷產率。
3)宏基因組分析結果表明，投加污泥炭提高了優勢菌屬Coprothermobacter、Fervidobacterium、Bellilinea以及代謝底物廣泛的優勢產甲烷古菌Methnosarcina的相對豐度；在產甲烷代謝通路方面，投加污泥炭使得表達乙酸裂解途徑和H2還原CO2途徑的關鍵酶的相關基因豐度獲得明顯增加。（來源：上海交通大學環境科學與工程學院，湖南碧臣環境能源有限公司）
