抗生素(antibiotics)是主要由細菌、霉菌或其它微生物產生的次級代謝產物或人工合成的類似物，它能在較低濃度下有選擇性地作用于菌體細胞特定環節，干擾細胞的代謝作用，妨礙生命活動或使停止生長，甚至死亡.中國是抗生素使用大國，也是抗生素生產大國，據國家衛生部醫院管理研究所藥事管理研究部對抗生素濫用公共安全問題研究提供的資料，我國每年抗生素原料生產量約為21萬t，18萬t在國內銷售，人用、牲獸用各一半，人均消費量138 g，是美國人均使用量的10倍以上(美國僅13 g).據WHO資料顯示，我國抗生素使用率中，門診感冒患者75%、外科手術高達95%、住院患者80%，其中使用廣譜抗生素和聯合應用的患者占58%，遠高于國際上規定的抗生素使用率不超過30%的標準.因此，相比歐美國家，中國的抗生素濫用現象尤為凸顯，且日益嚴重.
進入人和其它動物體內的抗生素大多不能被充分吸收利用，隨排泄物進入廢水或直接排入環境.相關研究表明現階段的水處理技術對污水中含有的相當一部分抗生素沒有明顯的去除效果，雖然抗生素的半衰期很短，但是由于頻繁的使用和排入，導致抗生素在水體中形成持續存在的狀態，影響水環境系統，進而對人類健康及整個生態造成長期的潛在危害.有報道指出:由于受某藥廠排放抗生素污水的影響，南京自來水中甚至檢測出了阿莫西林，水體中抗生素的污染風險引起了廣泛的關注.但目前，我國對水體中抗生素的研究主要集中在河流、河口、海灣、水庫等水體，如廣西邕江、大遼河、珠江口、欽州灣、深圳鐵崗、西麗水庫;此外還有渤海灣、萊州灣、白洋淀、維多利亞港和珠江、黃浦江等水環境中.太湖貢湖灣是無錫和蘇州兩城市重要的水源地，其周邊經濟發達，人口密度大，因此其水質安全對于無錫和蘇州的發展極為重要.有研究表明貢湖周圍分布有大量人口，且存在禽畜養殖和較大面積水產養殖，因此抗生素使用量較大，這些抗生素如若處理不當進入水體，會給貢湖生態安全帶來極大風險.但目前關于貢湖水中抗生素污染的研究還較少，為此本文以貢湖表層水為研究對象，分析其中抗生素的組成及分布特征，并初步評價其生態風險，以期為貢湖的污染防治及環境保護提供科學的參考依據.
1 材料與方法
1.1 采樣點設置
貢湖是位于太湖東北部的一個湖灣，西北臨無錫市，西南與太湖相通，面積147 km2，平均水深2 m，是無錫和蘇州兩個城市重要的水源地[19]，為了全面了解貢湖水域的抗生素污染情況及其風險程度，共布設9個采樣點，其中包括貢湖主要河流長廣溪、小溪港、望虞河、金墅港、石帆港等河口.并根據蘇錫二市貢湖水域的劃分、采樣點分布區域的特點將其分為南北兩區，采樣點位置及分布圖見表 1、圖 1.
圖 1 貢湖灣采樣點分布示意
表 1 貢湖灣采樣點位置分布表
1.2 試劑與儀器
所用主要設備有: Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL, 美國Waters公司);配有三重四級桿檢測器的高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS, Agilent 1200-6410A, 美國);ZORB-AXC18色譜柱(4.6 mm×150 mm×5.0 μm)混合纖維素脂微孔濾膜(0.22 μm，0.45 μm);氮吹儀;固相萃取裝置.
所用主要藥品: Milli-Q實驗用水(Millipore, Bedford, MA, 美國);硫酸;甲酸、乙腈、甲醇(HPLC級, J.T.Baker公司，美國);乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA, 分析純).
抗生素目標物:四環素(tetracycline, TC)、金霉素(chlortetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline，OTC)、環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)購自中國藥品生物制品檢定所;氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)、恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)、磺胺醋酰(n-sulfanilylacetamide, SAAM)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SMR)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine, SMP)、磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine, SMD)、磺胺甲基異唑(sulfamethoxazole, SMX)、磺胺喹啉(sulfaquinoxaline, SQX)、甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim, TMP)、磺胺間二甲基嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、羅紅霉素(roxithromycin, ROX)標樣購自德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司.內標指示物:儀器內標13 C3-咖啡因(13 C3-caffeine, I. S.)，購自美國劍橋同位素實驗室;回收率指示物: 13 C6-磺胺甲噻二唑(13 C6-sulfamethizole, S. S.)，購自Toronto Research Chemicals Inc.(North York，ON，加拿大).上述標準物均為固體純品，純度>95%.
1.3 樣品采集及預處理
樣品采集:采樣日期為2013年8月上旬，時間為上午09:00，采用GPS定位儀定位.水樣均采集表層水，樣品采集后置于棕色玻璃瓶中，加入3 mol ·L-1的硫酸溶液調節pH=3，避光低溫保存盡快運輸至實驗室，并存放至4℃冰箱以待測定.抗生素由國家環境分析檢測中心檢測.
樣品預處理:取水樣500 mL，然后調節pH=3.0，并使用0.45 μm的混合纖維素脂微孔濾膜濾除水中懸浮顆粒物，加入回收指示劑13 C-磺胺甲噻二唑50.0 μL (標準樣品質量濃度為1.0 mg ·L-1)和金屬離子耦合劑Na2EDTA 0.4 g，使樣品混合均勻待測.并使用活化后的HLB小柱進行富集.待樣品富集完成后，依次使用4 mL高純水和4 mL 10%的甲醇進行清洗，然后在氮氣保護下干燥30~45 min除去殘留水分，再使用8 mL甲醇對HLB小柱淋洗，將富集的物質洗脫下來，收集洗脫液于10 mL試管中，并在40℃水浴條件下氮吹濃縮至近干后用10%甲醇溶液將樣品定容至1.0 mL，加入內標指示劑13 C3-咖啡因(CAF)，將定容后的溶液通過0.22 μm纖維濾膜過濾后，使用液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)進行檢測.
1.4 HPLC-MS/MS儀器分析條件
色譜條件:所使用色譜柱為ZARBAX Eclipse plus C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm).流動相A為乙腈，B為0.1%的甲酸溶液，流速設定為300 μL ·min-1，進樣量為10 μL, 柱溫為30℃.實驗操作中具體的梯度淋洗程序參數見表 2.每個梯度洗脫操作完成后還原流動相位初始狀態，并穩定3 min.
表 2 梯度洗脫程序分離參數
質譜條件:采用多反應監測(MRM)模式進行檢測.離子源為電噴霧離子源(ESI)，在正離子模式下掃描，霧化器壓力為40 psi，毛細管電壓為4000 eV，干燥器流速穩定為8 L ·min-1.
質量控制:采用內標法對樣品進行定量分析，在優化條件下進行測定，使用抗生素標準溶液的質量濃度為1.0~500 μg ·L-1范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2均不低于0.99(P < 0.05).準確量取500 mL水，按照實驗方法加入25 ng混合標準品，測定6次，由6個樣品測定的標準偏差計算檢出限和最低定量濃度.當加標水平為0.05 μg ·L-1時，6次實驗的RSD (相對標準偏差)為2.70%~12.90%，各目標物的回收率為71%~105%，說明該方法重現性較好[21].檢出限為0.003~0.016 μg ·L-1，最低定量濃度為0.011~0.054 μg ·L-1 .
1.5 生態風險評估方法
根據歐盟的技術指導文件(TGD)中關于環境風險評價的方法，藥品在環境中的生態風險可以根據風險商值(RQs)大小來評估. RQs的計算可以通過污染物的環境預測濃度(predicted environmental concentration, PEC)或者實際監測濃度(measured environmental concentration, MEC)與預測無效應濃度(predicted no-effect cocentration, PNEC)的比值獲得:
式中，PEC:環境預測濃度，ng ·L-1;MEC:環境實測濃度，ng ·L-1;PNEC:預測無效應濃度，ng ·L-1;LC50:半致死濃度，ng ·L-1;EC50:半最大效應濃度，ng ·L-1，LC50與EC50均由查文獻所得;AF:評價因子;RQs:綜合毒性熵值.
環境生態風險的高低根據Hernando等[25]提出的RQs分類方法來評估生態風險等級: RQs < 0.1為最低風險;0.1≤RQs < 1為中等風險;RQs≥1為高風險.
2 結果與討論
2.1 貢湖灣水體中抗生素的濃度分布
貢湖灣水體中監測的16種抗生素，分4大類:四環素類(TC、OTC、CTC)、喹諾酮類(NOR、OFL、CIP、ENR)、磺胺類(SAAM、SMR、SMP、SMD、SMX、SQX、SDM、TMP)、大環內酯類(ROX).在檢測分析的16種抗生素中，除了磺胺醋酰(SAAM)、磺胺二甲基嘧啶(SMD)和磺胺間二甲基嘧啶(SDM)外，其余13種都有不同程度的檢出.各采樣點抗生素檢出質量濃度見圖 2、圖 3.采樣點2總抗生素檢出殘留量最高，達6.504 μg ·L-1.
(a)、(b)、(c)、(d)分別表示四環素類、喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類抗生素在各采樣點的質量濃度以及所占該點的總抗生素濃度的百分含量
圖 2 貢湖灣四類抗生素在各采樣點的質量濃度分布及其百分含量
圖 3 貢湖灣各采樣點抗生素質量濃度與種類分布
土霉素(OTC)、氧氟沙星(OFL)、磺胺甲基異唑(SMX)在采樣點2檢出量最高，分別為4.72、0.474和0.007 μg ·L-1.環丙沙星(CIP)和甲氧芐氨嘧啶(TMP)在采樣點4檢出量最高分別為0.269 μg ·L-1和0.208 μg ·L-1.四環素(TC)、諾氟沙星(NOR)和羅紅霉素(ROX)在采樣點5檢出量最高，分別為1.85、0.271和0.023 μg ·L-1.恩諾沙星(ENR)、磺胺甲基嘧啶(SMR)在采樣點6檢出量最高，分別為0.229 μg ·L-1和0.017 μg ·L-1.金霉素(CTC)和磺胺喹啉(SDM)在采樣點7檢出量最高，分別為1.03 μg ·L-1和0.005 μg ·L-1.磺胺甲氧噠嗪(SMP)在采樣點8檢出量最高，為0.478 μg ·L-1.
從圖 2可以看出，四環素類抗生素北區明顯高于南區，且2號點最高，其中土霉素(OTC)在北區1~4號點質量濃度遠高于北區的5號以及南區其余四點.北區1~5號點以及南區6~8三點四環素類抗生素占該點的總抗生素質量濃度的50%以上.喹諾酮類主要分布在北區2~4號和南區6、7、9號采樣點，且占9號采樣點總質量濃度的50%以上.磺胺類在南區6~8點普遍偏高，其中磺胺甲氧噠嗪(SMP)含量最高，這是一種在中國使用較多的畜用抗生素之一，在南區較高的原因可能與南區的大面積的水產養殖有關.此外大環內酯類羅紅霉素各點差異不大，且都不是各點抗生素的主要組成.
綜上，各抗生素的總檢出水平為:土霉素(OTC)>四環素(TC)>金霉素(CTC)>磺胺甲氧噠嗪(SMP)>氧氟沙星(OFL)>諾氟沙星(NOR)>甲氧芐氨嘧啶(TMP)>恩諾沙星(ENR)>環丙沙星(CIP)>羅紅霉素(ROX)>磺胺甲基嘧啶(SMR)>磺胺甲基異唑(SMX)>磺胺喹啉(SQX).按照抗生素種類，四類抗生素的檢出水平為:四環素類(n.d~4.72 μg ·L-1)>磺胺類(n.d~0.478 μg ·L-1)>喹諾酮類(0.014~0.474 μg ·L-1)>大環內酯(0.014~0.023 μg ·L-1).參照表 3可知，與我國其它地表水環境中主要抗生素質量濃度相比貢湖灣水域抗生素質量濃度處于一般水平，其中四環素類處于較高水平，而磺胺類、磺胺類、大環內酯相比處于稍低水平.
表 3 國內不同水體中抗生素質量濃度比較
2.2 貢湖灣抗生素的污染特征
根據貢湖周邊環境和行政區劃，貢湖分為南、北兩區(圖 1和表 1).所有監測的抗生素數據如表 4所示.
表 4 貢湖灣水體南北區抗生素質量濃度及檢出率
在檢出的13種抗生素中，喹諾酮類(NOR、OFL、CIP、ENR)和磺胺類中的甲氧芐氨嘧啶(TMP)以及大環內酯類的羅紅霉素(ROX)的檢出率為100%;其次為四環素類的土霉素(OTC)，檢出率高達89%;四環素(TC)和磺胺甲氧噠嗪(SMP)檢出率為78%;金霉素(CTC)檢出率為68%;其余3種檢出率都不足50%.
根據區域劃分，貢湖灣北區(1~5號采樣點)的5個采樣點中，監測的16種抗生素中共檢測出11種，其中四環素類3種，喹諾酮類4種，磺胺類有3種，大環內酯類1種;而在南區(6~9號采樣點)的4個采樣點中檢出12種抗生素，其中四環素類3種，喹諾酮類4種，磺胺類4種，大環內酯類1種.除此以外，南北兩區域檢出各種抗生素濃度的平均值也各有不同.
綜合表 4和圖 4可以看出來，在監測的點位上抗生素的平均值在南北兩個湖灣互有高低，各不相同.其中四環素類的檢出量明顯北部高于南部，特別是土霉素(OTC)尤為突出;而磺胺類和喹諾酮類抗生素的平均值南部相比北部相對要高一些，這說明南部灣這兩類抗生素的污染要更重一些;大環內酯類抗生素的平均值在兩個湖灣內含量相當.
圖 4 貢湖灣南北湖灣抗生素質量濃度
由于貢湖的抗生素主要來源于周邊的水產養殖、禽畜養殖使用的抗生素對貢湖的輸入及貢湖流域居民藥用抗生素殘留的輸入.因此，出現這樣的現象的主要原因是南北兩湖灣的周圍的環境不同.曹卉等在2011年的研究中劃定了環貢湖范圍離岸3 km內的148 km2區域，區域內共有13.71萬人，其中在北部灣的無錫境內有7.21萬人，占全部的54.6%，其中城鎮和鄉村人口分別占36%和67%;而蘇州境內的6.5萬人中鄉村人口占到97%，城鎮人口僅為3%.除此之外，在貢湖研究區域3 km以外地區無錫境內城鎮化程度也相對高于該地區蘇州境內的城鎮化程度.而四環素類作為抗菌譜廣，價格便宜的抗生素藥，在城鎮化程度高的地方使用量遠多于鄉村，因此可能造成四環素類在北部灣比南部灣高一些.相比之下，南部灣蘇州地區的5萬人中，有97%的為鄉村人口，養殖牲畜較多，且貢湖區域內有魚塘6320 km2，全部位于南部灣蘇州境內的通安鎮和東渚鎮，主要分布在渚鎮河、游湖及田雞港河道兩側，農用、畜牧養殖業或動物疾病治療藥物的抗生素使用量相對較高.喹諾酮類作為人畜共用抗生素在我國被廣泛應用，且被認為是理想的抗菌藥物，在我國普遍且大量用于禽畜養殖;磺胺類抗生素由于其抗菌譜廣、療效強等特點在我國已廣泛應用于如畜牧養殖和水產養殖等的養殖業.南部湖灣地區由于村鎮較多相比禽畜養殖較多，同時貢湖水域的全部水產養殖都位于南部湖灣的蘇州地區，這可能是造成這兩類抗生素在南部湖灣較高的原因.
2.3 貢湖灣抗生素生態風險評價
本研究中，PNEC值是通過閱讀文獻收集抗生素對一些物種的急性和慢性毒理數據求出的[20, 28~33].基于最壞情況考慮，PNEC計算篩選使用最敏感物種獲得，同時環境中實測抗生素濃度選擇最大值計算.計算結果見表 5.
表 5 抗生素對應最敏感物種毒理數據
根據RQs風險熵值的計算評價方法，計算得貢湖灣檢測出的13種抗生素RQs值如表 6.從中可看出處于高風險抗生素有5種，占檢出種類38.5%，分別為四環素類OTC以及喹諾酮類NOR、OFL、CIP和ENR，說明貢湖灣中四環素類中OTC以及喹諾酮類4種抗生素對貢湖中相應敏感水生生物存在慢性或急性毒性風險;處于中風險有4種，占檢出種類的30.8%，分別為TC、CTC、ROX和SMX;其余4種抗生素處于低風險，占檢出種類的30.8%，分別為SMR、SMP、SQX和TMP，其生態風險并不顯著.
表 6 貢湖灣水域抗生素風險商值
評價結果顯示，處于中高風險的9種抗生素中包括監測四環素類全部4種、喹諾酮類全部4種和大環內酯類全部1種以及磺胺類1種，環丙沙星(CIP)尤為突出.四環素類和喹諾酮類及大環內酯類羅紅霉素主要用于醫藥或農用養殖用藥，具有相對較高的RQs風險，且這幾類抗生素在貢湖檢出質量濃度相對較高，這說明此類抗生素藥物在貢湖周圍居民中使用量較大，使用頻率高.殘留水中的抗生素可能會對水生生物產生一定的急性或慢性毒性效應，同時抗生素的長期殘留還可能會刺激病原菌產生耐藥性，這勢必會對原有穩定的生態系統產生影響;其次，養殖用抗生素的大量使用可能會導致禽畜魚類產生耐藥性，長期食用具有耐藥性的肉和蛋對人類健康可能具有潛在威脅.同時，醫用的四環素類和大環內酯類羅紅霉素以及人用的喹諾酮類的濫用可能會使病菌產生抗藥性，進入體內未被完全代謝的抗生素會在人體內富集，威脅人體健康;此外，抗生素的頻繁過量使用容易引發毒副作用，從而影響人體健康.
綜上所述，當前貢湖水域抗生素風險問題不容忽視，應該引起注意并加以防范，避免濫用現象，從而降低相應生態風險.具體參見污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關技術文檔。
3 結論
(1)貢湖灣水體監測的16種抗生素，除磺胺醋酰(SAAM)磺胺二甲基嘧啶(SMD)和磺胺間二甲基嘧啶(SDM)外，共檢出13種抗生素，質量濃度范圍0.005~4.720 μg ·L-1. 13種抗生素中，OTC (土霉素)檢出濃度最高，4.720 μg ·L-1;SQX (磺胺喹啉)檢出濃度最低，僅為0.005 μg ·L-1，且僅在7號采樣點有檢出.四類抗生素檢出水平為:四環素類(n.d~4.72 μg ·L-1)>磺胺類(n.d~0.478 μg ·L-1)>喹諾酮類(0.014~0.474 μg ·L-1)>大環內酯(0.014~0.023 μg ·L-1).對比國內其他水體環境，貢湖灣水體抗生素質量濃度總體上處于一般水平，但局部采樣點(如2號點)和個別抗生素(如土霉素、喹諾酮類)檢出濃度較高，應該引起足夠的注意.
(2)貢湖水體中檢出的13種抗生素中，喹諾酮類(NOR、OFL、CIP、ENR)和磺胺類中的甲氧芐氨嘧啶(TMP)以及大環內酯類的羅紅霉素(ROX)的檢出率為100%，其余檢出率也是相對較高的，這說明在貢湖灣周圍抗生素使用量大.同時，檢出抗生素在南北兩湖灣的檢出水平互有高低，其中四環素類抗生素北部灣要高于南部灣，而喹諾酮類和磺胺類抗生素南部灣的檢出量要高與北部灣，這是由于南北湖灣周邊不同的社會生活環境造成的.
(3)通過風險商值法評價檢出的13種抗生素，結果表明貢湖灣水域中檢出的抗生素中，處于高風險的(即RQs>1)抗生素有5種(OTC、NOR、OFL、CIP、ENR)，占檢出種類38.5%，其中環丙沙星(CIP)尤為突出;中風險(0.1 < RQs < 1)有4種(TC、CTC、ROX、SMX)，占檢出種類30.8%;其余4種(SMR、SMP、SQX、TMP)為低風險(RQs < 0.1).整體來看，貢湖水域抗生素存在一定生態風險，尤其是四環素類和喹諾酮類風險程度較高，應引起足夠的注意，并采取相應防范措施.
