1 引言

　　抗生素的大規(guī)模生產(chǎn)和使用已經(jīng)持續(xù)了70多年，極大地促進(jìn)了人類的健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn).但越來(lái)越多的證據(jù)顯示(Toleman et al., 2007)，隨著抗生素的使用，微生物(包括病原菌和非病原菌)對(duì)抗生素的抗性在逐年增加，抗生素抗性基因通過(guò)水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)入各種病原菌，給人類健康和環(huán)境安全構(gòu)成了巨大的潛在危害.2011年德國(guó)爆發(fā)的“毒黃瓜”事件短期內(nèi)使歐洲33人死亡、3000多人被感染，因?yàn)榇舜我咔榈腛104：H4血清型腸出血性大腸桿菌攜帶有氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等多種抗生素的抗性基因，導(dǎo)致多種抗生素治療無(wú)效(蘇建強(qiáng)等，2013).臨床上常見(jiàn)的一種致病菌——波美不動(dòng)桿菌，在30多年的時(shí)間里從一種對(duì)大多數(shù)抗生素敏感的細(xì)菌發(fā)展到了帶有45種抗生素抗性基因的“超級(jí)細(xì)菌”，這些抗性基因通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移來(lái)源于各種環(huán)境微生物(Fournier et al., 2006).歐洲每年大約25000人死于抗生素抗性細(xì)菌，美國(guó)每年至少2000000人的疾病和23000人的死亡是由于抗生素抗性所導(dǎo)致.因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將抗生素抗性基因(ARGs)作為21世紀(jì)威脅人類健康的最重大挑戰(zhàn)之一，并將在全球范圍內(nèi)對(duì)控制ARG進(jìn)行戰(zhàn)略部署.

　　由于抗生素不僅能夠防治疾病，而且能夠提高飼料效率、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，因此，獸用抗生素(如四環(huán)素、泰樂(lè)菌素等)和一些微量金屬元素如Cu、Zn、As等作為飼料添加劑在集約化畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)得到了廣泛使用.但抗生素和微量金屬元素不能在動(dòng)物體內(nèi)完全代謝降解、吸收，這就導(dǎo)致相當(dāng)比例的抗生素和大部分微量金屬元素隨糞便排泄出來(lái)，例如，約30%～90%的抗生素以母體的形式和大部分銅(隨糞便排出體外，導(dǎo)致畜禽糞便中含有高濃度的殘留抗生素和重金屬.這些有毒有害污染物不僅嚴(yán)重威脅畜禽產(chǎn)品安全，而且隨著畜禽糞污農(nóng)用進(jìn)入土壤、水體環(huán)境，導(dǎo)致微生物的抗性逐年增加，并且抗性基因通過(guò)水平轉(zhuǎn)移，對(duì)環(huán)境和人體健康構(gòu)成了巨大的潛在危害.

　　畜禽養(yǎng)殖糞污不僅污染物排放量大，而且常規(guī)污染物質(zhì)化學(xué)需氧量、氮磷與有毒有害物質(zhì)殘留抗生素、重金屬并存，呈現(xiàn)復(fù)合污染特征，是環(huán)境的主要污染源之一，并已成為抗生素抗性基因重要的蓄積庫(kù).根據(jù)2010年發(fā)布的《第一次全國(guó)污染源普查公報(bào)》，我國(guó)2007年度集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞便產(chǎn)生量為2.43億t，尿液產(chǎn)生量為1.63億t，其中主要水污染物排放量中銅為2397.23 t，鋅為4756.94 t.畜禽糞便已成為英國(guó)土壤中Cu、Zn等重金屬的重要來(lái)源，其對(duì)土壤Cu和Zn積累的年貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了37%~40%和8%~17%(Nicholson et al., 2003).由于抗生素和重金屬在畜禽養(yǎng)殖中的廣泛使用，這不僅導(dǎo)致畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)及其周邊形成了一個(gè)重金屬和抗生素交叉污染的典型環(huán)境，而且重金屬對(duì)抗生素抗性基因的長(zhǎng)期選擇壓力及重金屬抗性基因和抗生素抗性基因的交叉分布特征更是加劇了這種污染.例如，已有研究表明，抗生素抗性基因的豐度與抗生素和砷、銅等重金屬濃度顯著相關(guān)，這表明砷、銅等重金屬和抗生素的復(fù)合污染可以增加環(huán)境中抗性基因的豐度.相較于抗生素抗性基因，目前有關(guān)重金屬抗性基因在各種環(huán)境中的傳播、分布特征及轉(zhuǎn)歸機(jī)制的研究非常少，更遑論有關(guān)重金屬抗性基因控制的研究.

　　自2006年P(guān)ruden等將抗生素抗性基因作為一種新型環(huán)境污染物提出之后，有關(guān)其在各種環(huán)境中的傳播、分布特征及轉(zhuǎn)歸機(jī)制等研究已引起廣泛關(guān)注.生物處理(如厭氧發(fā)酵和好氧堆肥)和土地利用是畜禽糞便廣泛應(yīng)用的處理與處置方式.因此，在控制、治理和資源化利用畜禽養(yǎng)殖糞便中常規(guī)C、N、P污染物的基礎(chǔ)上，如何有效控制和削減抗生素與重金屬的復(fù)合污染及其抗性基因的水平傳遞，降低畜禽養(yǎng)殖糞便土地利用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)將是本領(lǐng)域的技術(shù)難題和前瞻性課題.所以，本文的目的就是通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，綜述國(guó)內(nèi)外抗生素抗性基因和重金屬抗性基因在畜禽糞便生物處理及土地利用全過(guò)程中的傳播、分布與控制的研究進(jìn)展，并對(duì)今后的研究重點(diǎn)和方向提出建議和展望，以期為我國(guó)畜禽養(yǎng)殖糞便的風(fēng)險(xiǎn)控制和資源化利用提供借鑒.

　　2 畜禽糞便中抗生素和重金屬抗性基因的賦存特征

　　畜禽糞便中殘留的抗生素和重金屬特征決定了環(huán)境中抗生素和重金屬抗性菌及其抗性基因的特征.不同國(guó)家和地區(qū)畜禽糞便中殘留的抗生素和重金屬差別很大(表 1).多項(xiàng)研究表明(Hölzel et al., 2010;Bibbal et al., 2007;Heuer and Smalla， 2007)，抗生素和重金屬的使用量同抗性基因的豐度顯著相關(guān).在受到畜禽糞便污染的水體中，抗性基因的豐度相對(duì)于未受污染的區(qū)域增加了2～3 logs.如Peak等(2007)考察了3種四環(huán)素使用水平的養(yǎng)牛場(chǎng)中6種四環(huán)素抗性基因豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素用量最大、用量較低和未使用的養(yǎng)牛場(chǎng)，其牛糞儲(chǔ)存池中tetR含量分別為2.8×106、5.1×103、7.3×105 copies · mL-1.

表1 畜禽糞便中殘留重金屬和抗生素的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)

Binh等(2008)發(fā)現(xiàn)，sul1、sul2、blaTEM及抗性質(zhì)粒在豬糞中的含量同養(yǎng)殖場(chǎng)中抗生素的使用量直接相關(guān).Looft等(2012)通過(guò)在飼料中添加金霉素、磺胺類抗生素及青霉素來(lái)研究豬腸道中抗性基因及微生物群落的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不僅3種抗生素的抗性基因豐度大幅增加，而且其它類抗生素(在本實(shí)驗(yàn)中未添加)的抗性基因豐度也增加了.

　　不同畜禽糞便中，不同抗生素抗性基因的豐度也存在很大差異，這不僅與抗生素的使用類型和使用量直接相關(guān)，而且可能與抗生素的區(qū)域性使用差異有關(guān).例如，在養(yǎng)豬場(chǎng)四環(huán)素類抗生素使用較多的地區(qū)，豬糞中殘留的四環(huán)素(表 1)及其抗性基因含量(表 2)較高;在養(yǎng)雞、養(yǎng)鴨場(chǎng)磺胺類抗生素使用較 多的地區(qū)，雞糞和鴨糞中殘留的磺胺類抗生素(表 1)及其抗性基因(表 2)的含量較高.同時(shí)，人們研究了減少抗生素使用量對(duì)抗生素抗性基因的削減作用.例如，Klare等(1999)調(diào)查了德國(guó)全面禁止畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中使用阿伏霉素(avopracin)之后豬肉和人糞便中大腸桿菌的阿伏霉素抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的阿伏霉素抗性明顯下降.在丹麥動(dòng)物飼料添加劑中禁用阿維霉素(avilamycin)、紅霉素(erythrocin)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)和維吉尼霉素(virginiamycin)之后，Aarestrup等(2001)調(diào)查了畜禽糞便中大腸桿菌對(duì)這幾種抗生素的抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性均有不同程度的降低.這些都說(shuō)明抗生素抗性的產(chǎn)生同抗生素的使用息息相關(guān).但是，這種抗性的降低只是表現(xiàn)在抗性程度上，而實(shí)際上抗性基因即使在沒(méi)有相應(yīng)抗生素存在時(shí)，也會(huì)存在長(zhǎng)達(dá)幾年的時(shí)間(Johnsen et al., 2009).另外，很有可能抗性基因潛伏在微生物體內(nèi)而沒(méi)有進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)生抗性，當(dāng)存在相應(yīng)的環(huán)境壓力時(shí)，通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)入合適的微生物體內(nèi)之后才會(huì)表現(xiàn)出抗性.

表2 文獻(xiàn)中有關(guān)畜禽糞便生物處理過(guò)程中抗生素抗性基因的分布

3 畜禽糞便生物處理過(guò)程中抗生素和重金屬抗性基因的賦存特征與削減效果

　　畜禽糞便生物處理的主要工藝為好氧堆肥和厭氧消化，均對(duì)抗生素抗性基因具有較好的削減效果.如Chen等(2007)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法調(diào)查了6種紅霉素抗性基因(erm)在牛糞和豬糞經(jīng)堆肥處理、豬糞廢水經(jīng)氧化溝和生物濾池處理后的豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比氧化溝和生物濾池處理豬糞廢水，堆肥可明顯削減豬糞中的erm抗性基因，削減率最高達(dá)到了7.3 logs，而其它處理工藝對(duì)抗性基因基本無(wú)削減.Cheng等(2013)調(diào)查了杭州8個(gè)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中10種四環(huán)素抗性基因、2種磺胺類抗性基因及整合子intl1的豐度和多樣性，并考察了3個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)不同廢水處理工藝(厭氧消化+ A/O工藝+生態(tài)溝)對(duì)這些抗生素抗性基因的削減情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12種抗性基因的豐度在經(jīng)過(guò)厭氧消化后，大部分有所降低，但在后續(xù)的生物處理過(guò)程中，基本無(wú)變化，有些抗性基因如sul1和sul2豐度反而有所增加.

　　目前尚未有針對(duì)畜禽糞便厭氧消化和堆肥過(guò)程中抗生素抗性基因變化的研究報(bào)道，而對(duì)污泥厭氧消化過(guò)程中抗生素抗性基因變化的研究較多.如Ma等(2011)在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了中溫和高溫厭氧消化對(duì)污泥中9種抗性基因的削減情況，結(jié)果表明中溫厭氧消化能大幅削減sulI、sulII、tetC、tetG和tetX，并且隨著水力停留時(shí)間的增加，削減效果更明顯，但tetW、ermB和ermF反而會(huì)增加;47 ℃、52 ℃、59 ℃的高溫厭氧消化能夠更有效地削減tetW、ermB、tetO、tetX和ermB、ermF，卻對(duì)其它抗性基因和intl1的削減效果很差，tetC和tetG反而有所增加;然而，污泥熱水解預(yù)處理能夠有效削減所有的抗性基因，但厭氧消化之后抗性基因都出現(xiàn)了反彈.Diehl和LaPara(2010)在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了22 ℃、37 ℃、46 ℃、55 ℃條件下厭氧消化和好氧消化對(duì)污泥中tetA、tetL、tetO、tetW、tetX和intl1的削減情況，結(jié)果表明在37 ℃、46 ℃、55 ℃厭氧條件下，各種抗性基因都能大幅削減，但在好氧條件下各種抗性基因卻基本無(wú)削減，他們據(jù)此提出高溫厭氧消化或許是削減各種抗性基因較好的方式.

　　重金屬抗性基因在畜禽糞便生物處理過(guò)程中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.總之，好氧堆肥和厭氧消化對(duì)畜禽糞便中抗生素和重金屬及其抗性基因的削減均具有一定的效果，但工藝類型、工藝操作參數(shù)及微生物群落等對(duì)畜禽糞便生物處理過(guò)程中抗生素和重金屬及其抗性基因賦存與轉(zhuǎn)歸的影響，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究.

　　4 畜禽糞便土地利用過(guò)程中抗生素和重金屬抗性基因的賦存特征

　　畜禽糞便的土地利用給環(huán)境帶來(lái)了大量攜帶有抗性基因的微生物，但這些微生物所帶來(lái)的影響，相對(duì)于攜帶的抗性基因來(lái)說(shuō)，可能只是瞬時(shí)的(Heuer and Smalla， 2007).Heuer等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，豬糞施入土壤后，土壤中微生物群落在前10 d受到了較大的影響，但很快又恢復(fù)了;而在175 d之后土壤中sul1和sul2兩種抗性基因的豐度仍然達(dá)到了10-5 copies/16S rRNA.Heuer和Smalla(2007)研究了糞便和磺胺類抗生素對(duì)耕地中抗生素抗性基因的協(xié)同選擇作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同作用至少持續(xù)了兩個(gè)月，這主要是因?yàn)榧S便中攜帶有更多的伴隨有多種抗性基因的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到土壤中土著微生物體內(nèi)，極大地延長(zhǎng)了抗生素抗性基因在土壤中的存活時(shí)間.Knapp等(2010)分析了新西蘭在1940—2008年間的土壤樣品，發(fā)現(xiàn)自從1940年開(kāi)始大面積使用抗生素之后，土壤中β-內(nèi)酰胺類、紅霉素及四環(huán)素抗性基因的豐度逐年增加，并且還在繼續(xù)增長(zhǎng)，這與自1950年開(kāi)始大規(guī)模使用獸用抗生素一致.總之，畜禽糞便中微生物進(jìn)入土壤之后，并沒(méi)有對(duì)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生太大的影響，但其中的抗性基因通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移，卻在土壤中保留了很長(zhǎng)時(shí)間(表 3).

表3 畜禽糞便及其土地利用中抗生素抗性基因的分布a 

土壤性質(zhì)對(duì)抗性基因的保留也有很大的影響.Munir等(2011)研究了施用豬糞和污泥的不同農(nóng)田中tetO、tetW及sulI的豐度變化情況，發(fā)現(xiàn)農(nóng)田A(壤土)中3種抗生素抗性基因的豐度均增加，而農(nóng)田B(沙壤土)卻無(wú)明顯變化.由于其它各種復(fù)雜的原因，目前不僅很難清晰地說(shuō)明畜禽糞便對(duì)土壤中抗生素抗性基因的分布究竟有什么作用(Heuer et al., 2011)，而且土壤理化特性對(duì)抗性基因賦存特征的影響也不清楚，這些均有待今后的深入研究.

　　畜禽糞便中重金屬如Cu、Zn、As等間接促進(jìn)了抗生素抗性基因的產(chǎn)生.如表 4所示，某些重金屬和抗生素具有相同的抗性機(jī)制，因此，在重金屬抗性增加的同時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致抗生素抗性的產(chǎn)生或加強(qiáng)(Ji et al., 2012).如Berg等(2010)通過(guò)未培養(yǎng)的方法，證明了Cu對(duì)四環(huán)素和萬(wàn)古霉素的抗性基因具有聯(lián)合選擇壓力.Silveira等(2014)研究了從各種環(huán)境中篩選出的腸球菌(Enterococcus)中Cu抗性基因和ARGs的聯(lián)合轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物的Cu抗性對(duì)腸球菌中的多重耐藥性產(chǎn)生了選擇壓力，證明了Cu抗性基因(tcrB和cueO)在腸球菌中的水平轉(zhuǎn)移，并且這種Cu抗性的水平轉(zhuǎn)移同時(shí)伴隨著紅霉素、四環(huán)素、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、氨芐青霉素等多種抗性的轉(zhuǎn)移.Nishino等(2007)研究了多重耐藥菌沙門氏菌中雙組分調(diào)控系統(tǒng)BaeSR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)調(diào)節(jié)因子baeR高效表達(dá)時(shí)，能夠顯著提高Salmonella enterica的多重耐藥性和Cu、Zn的抗性，baeR控制了mdtABC操縱子和tolC、acrD的表達(dá)，mtdABC和acrD同時(shí)決定了Salmonella enterica的多重耐藥性和Cu、Zn的抗性.也就是說(shuō)，Cu和Zn的選擇壓力均會(huì)導(dǎo)致baeR的高效表達(dá)，進(jìn)而影響mdtABC操縱子和tolC、acrD的表達(dá)，從而導(dǎo)致Salmonella enterica抗生素抗性的增加.因此，在考察畜禽糞便土地利用對(duì)土壤中抗生素抗性基因的影響時(shí)，不僅應(yīng)該考慮抗生素類物質(zhì)，而且應(yīng)考慮Cu、Zn、As等微量元素的影響.

表4 具有相同抗性機(jī)制的重金屬和抗生素

土壤中土著細(xì)菌含有許多抗性基因，現(xiàn)在用于大規(guī)模生產(chǎn)的抗生素生產(chǎn)菌基本都來(lái)自于土壤.但是，同畜禽糞便相比，土壤細(xì)菌自身攜帶的抗性基因無(wú)論在數(shù)量上還是在自身屬性上均有很大區(qū)別.例如，在數(shù)量上，Yang等(2010)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，雖然沒(méi)有在美國(guó)洛杉磯國(guó)家公園土壤中檢測(cè)到tetB、tetC、tetW和tetO，但這些基因卻大量存在于其它受農(nóng)業(yè)活動(dòng)影響的276個(gè)土壤樣品中.其次，從抗性基因?qū)傩詠?lái)看，土著細(xì)菌所攜帶的抗性基因大多同微生物正常的新陳代謝聯(lián)系在一起，使微生物在低濃度的抗生素條件下生存，很少同水平轉(zhuǎn)移因子結(jié)合在一起(Baquero et al., 2009).但是，在較大的環(huán)境選擇壓力下，如畜禽糞便中所含的抗生素和重金屬，這些抗性基因會(huì)進(jìn)行復(fù)制，并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒上以獲得更高的抗性水平.而這些轉(zhuǎn)座子和廣譜的質(zhì)粒或者其他的基因擴(kuò)散因子，進(jìn)入更大范圍的微生物，從而使抗性基因得到了傳播(Martínez2007 et al., 2007).

　　目前有關(guān)施用畜禽糞便的土壤中重金屬抗性基因的分布特征尚未見(jiàn)報(bào)道，但是施用含重金屬的有機(jī)糞肥后，土壤中微生物的重金屬和抗生素抗性均產(chǎn)生了明顯的變化.如Berg等(2010)的研究表明，含Cu有機(jī)肥進(jìn)行土地利用后，Cu的加入不僅增加了土著微生物的Cu抗性，而且間接增加了具有Cu抗性微生物的抗生素抗性.

　　總之，現(xiàn)階段畜禽糞便土地利用過(guò)程中抗生素、重金屬、抗生素抗性基因的分布特征研究多集中在單因素，不僅缺乏復(fù)合污染條件下抗生素抗性基因的遷移與傳播機(jī)制研究，而且重金屬抗性基因的遷移轉(zhuǎn)化有待進(jìn)一步明確，同時(shí)迫切需要深入研究畜禽糞便的施用頻率、施用量、施用時(shí)間和土壤類型、植物類型等對(duì)土地利用過(guò)程中抗生素和重金屬及其抗性基因賦存與轉(zhuǎn)歸的影響.

　　5 抗生素和重金屬抗性基因產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、分布的微生物學(xué)機(jī)理

　　抗生素抗性基因在不同環(huán)境中相互影響，并呈現(xiàn)一定的全球性.已有調(diào)查顯示，從未使用過(guò)抗生素的環(huán)境中，抗生素抗性基因的數(shù)量卻在逐年增加(Segawa et al., 2013)，這同抗性基因的傳播方式和途徑息息相關(guān).

　　現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的機(jī)制主要有4種(Allen et al., 2010)：細(xì)胞通透性障礙、外排泵、抗性突變和抗生素失活機(jī)制.不同抗生素產(chǎn)生的抗性機(jī)制不一樣.以四環(huán)素抗性基因?yàn)槔?圖 1)，迄今為止主要有35種類型的四環(huán)素抗性基因，包括外排泵機(jī)制24種、抗生素失活機(jī)制1種、核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制(抗性突變機(jī)制)10種(McArthur et al., 2013).一般在研究抗生素抗性基因分布的時(shí)候，往往選擇特定幾種抗性基因來(lái)研究，以四環(huán)素抗性基因?yàn)槔�，外排泵機(jī)制選擇tetG、tetA、tetC等較多，酶失活機(jī)制選擇tetX，核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制選擇tetM和tetQ較多.這幾類四環(huán)素抗性基因在環(huán)境中豐度一般比較高，具有代表性.不同環(huán)境中并不是存在所有抗性機(jī)制的抗性基因，這可能同定量PCR方法有一定的檢測(cè)限有關(guān).如Zhu等(2013)采用定量PCR方法檢測(cè)到了28種四環(huán)素抗性基因中的22種.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新的抗性基因也不斷被發(fā)現(xiàn).如Su等(2014)利用功能基因組學(xué)的方法，篩選了不同土壤環(huán)境樣品中多種抗生素抗性基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同已發(fā)現(xiàn)的抗生素抗性基因相比，氨基酸水平上只有2%的抗性基因的相似性在90%以上，67%以上抗性基因的相似性低于60%.這說(shuō)明環(huán)境中還有很多尚未被認(rèn)識(shí)的抗性基因.另外，微生物不斷進(jìn)化，人們相信新的抗生素抗性機(jī)制也會(huì)隨之產(chǎn)生(Karisetty et al., 2013).

圖 1 四環(huán)素抗性基因

水體、土壤和工業(yè)廢棄物中的許多微生物都表現(xiàn)出了對(duì)重金屬的抗性.同抗生素抗性基因一樣，重金屬抗性基因存在于染色體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子，有時(shí)兩者連接在一起.由于不同重金屬的電化學(xué)性質(zhì)不一樣，微生物對(duì)其抗性機(jī)制也有較大差別.現(xiàn)階段主要有6種重金屬抗性機(jī)制：細(xì)胞通透性障礙、細(xì)胞內(nèi)外螯合、外排泵、酶解毒和降低受體敏感性.目前針對(duì)環(huán)境樣品中重金屬抗性的研究比較多，但是針對(duì)重金屬抗性基因的研究比較少，大多是針對(duì)某個(gè)具體的微生物.以Cu為例，研究較多的是黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中的抗性基因變化情況.如Behlau等(2013)研究了同柑橘相關(guān)的黃單胞桿菌屬中Cu抗性基因的變化情況，證明了Cu抗性基因復(fù)雜的來(lái)源.Abou-Shanab等(2007)的研究結(jié)果表明，各種重金屬的抗性基因都是大量存在于從含重金屬Ni豐富的土壤及庭薺根際中篩選出的G+菌和G-菌.

　　畜禽糞便攜帶大量的具有抗性的微生物，這些微生物帶有大量的可移動(dòng)因子如整合子、轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒等，進(jìn)入環(huán)境后，增加了環(huán)境的抗生素抗性.基因的水平轉(zhuǎn)移(Horizontal Gene Transfer，HGT)是抗性擴(kuò)散的主要因素，這是因?yàn)樾笄菁S便中的微生物并不能很好地適應(yīng)新環(huán)境.已有研究表明，畜禽糞便中微生物群落結(jié)構(gòu)完全不同于其他環(huán)境如土壤，畜禽糞便土地利用幾個(gè)月之后，土壤中就很難再檢測(cè)到來(lái)自于畜禽糞便中的微生物.但HGT卻使大量的可移動(dòng)因子進(jìn)入到土著細(xì)菌，從而使抗性基因在土壤中長(zhǎng)期存在.已有研究表明，豬糞能夠促進(jìn)抗性基因的水平轉(zhuǎn)移，并且抗生素能夠進(jìn)一步增加整合酶和轉(zhuǎn)移酶的活性，從而促進(jìn)基因的水平轉(zhuǎn)移，而這得益于細(xì)胞自身的SOS效應(yīng).現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種類型的整合子和成千上萬(wàn)的移動(dòng)基因盒，而整合子分布于染色體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上，但有趣的是抗生素抗性基因盒大多整合在質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的整合子上，很少整合在染色體的整合子上，這些都加劇了抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移.例如，現(xiàn)在研究最多的1類整合子主要是插入在Tn402家族的轉(zhuǎn)座子上，并且捕捉sul1基因盒，這對(duì)很多臨床上微生物抗性基因的聚集有很大關(guān)系.

　　另一方面，抗生素抗性基因進(jìn)入受體細(xì)胞之后，需要表達(dá)來(lái)抵抗外來(lái)抗生素的影響，這增加了受體細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，但通過(guò)質(zhì)粒載體進(jìn)入細(xì)胞之后，這種基因帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)就會(huì)少很多，而且在傳接幾代之后會(huì)明顯改善.另外，相當(dāng)一部分抗性基因在進(jìn)入受體細(xì)胞之后并不表達(dá)出活性，是一種沉默基因(Partridge et al., 2009)，在沒(méi)有抗生素存在時(shí)，以最小的代價(jià)使抗性基因得到擴(kuò)散，并且傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)不到.

　　不同的抗生素抗性基因可能同時(shí)存在于同一個(gè)質(zhì)�；蛘咿D(zhuǎn)座子上，也就是說(shuō)一種抗性基因的轉(zhuǎn)移和增殖，伴隨著另外一種抗性基因的轉(zhuǎn)移和增殖，或者是獲得了一種抗性基因之后，受體細(xì)胞對(duì)其它抗性基因的通透性加強(qiáng)，這樣就產(chǎn)生了多重抗性基因，導(dǎo)致一種微生物同時(shí)具有多重抗性.例如，盡管畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)未使用氨基糖苷類抗生素，但是氨基糖苷類抗生素抗性基因的數(shù)目卻增加了近1萬(wàn)倍;同樣地，在未使用酰胺醇類抗生素時(shí)，其抗性基因的豐度也增加了近500倍(Looft et al., 2012).這些都說(shuō)明了抗生素之間存在的共選擇作用(Co-selection).

　　重金屬和抗生素存在復(fù)合選擇壓力的現(xiàn)象，環(huán)境中的重金屬會(huì)促進(jìn)抗生素抗性的增加.Knapp等(2011)研究了土壤中內(nèi)在的抗生素抗性基因與重金屬之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多抗生素抗性基因的豐度與Cu含量呈顯著正相關(guān)(p≤0.05)，其它重金屬如Cd、Ni、Pb、Fe也與某些抗生素抗性基因呈正相關(guān).Berg等(2005)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用含Cu肥料后，Cu的加入不僅增加了土著微生物的Cu抗性，而且也間接增加了具有Cu抗性微生物的抗生素抗性.

　　從抗生素抗性基因和重金屬抗性基因復(fù)合分布的微生物角度來(lái)看，主要存在以下4種機(jī)制(見(jiàn)圖 2)：①交叉抗性.無(wú)論抗生素還是重金屬，任何一方的抗性增加均會(huì)導(dǎo)致另一方的抗性增加.如TetL蛋白不僅能夠向外排出四環(huán)素(Tet)，而且能夠排出Co2+.②共抗性.當(dāng)抗生素抗性基因和重金屬抗性基因處在同一段基因上時(shí)，那么一種抗性基因的增加就會(huì)導(dǎo)致另一種抗性基因的增加.如鏈霉素抗性基因(strB)和汞抗性基因(merE)共存于質(zhì)粒pHCM1，因此任何一個(gè)基因的擴(kuò)增均會(huì)伴隨著另外一個(gè)基因的同等擴(kuò)增.③共調(diào)節(jié)抗性.各種調(diào)節(jié)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平上是聯(lián)系在一起的，那么重金屬導(dǎo)致的抗性也會(huì)通過(guò)一種未知途徑增加抗生素的抗性.如mex操縱子和CZC操縱子共同調(diào)節(jié)亞胺培南(Imipenem)和Co、Zn、Cd的外排泵機(jī)制抗性(Perron et al., 2004).

圖 2 抗生素和重金屬抗性基因復(fù)合分布的微生物學(xué)機(jī)理

抗生素污染主要集中在抗生素集中利用的一些地區(qū)，一般環(huán)境條件下抗生素含量都比較低，而一般環(huán)境中重金屬含量往往是抗生素含量的幾十至幾百倍，所以重金屬對(duì)抗生素抗性基因的影響至關(guān)重要，另外，環(huán)境溫度、微生物群落結(jié)構(gòu)及其它性質(zhì)也會(huì)影響抗性基因的分布.至于哪種因素起到了決定性作用，現(xiàn)在尚無(wú)定論，需要進(jìn)一步的研究.

　　6 抗性基因的削減與控制

　　很多研究表明，傳統(tǒng)污水處理工藝對(duì)抗生素抗性基因和抗性菌的削減效果不明顯(佟娟和魏源送，2012)，甚至出現(xiàn)抗生素抗性基因經(jīng)過(guò)生物處理后增加的現(xiàn)象，但也有研究表明，傳統(tǒng)污水處理工藝對(duì)抗生素抗性基因具有明顯的削減效果.目前抗生素抗性基因的控制尚未有明確的解決辦法，但已有研究表明，污泥高溫厭氧消化對(duì)抗生素抗性基因的控制具有明顯的優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)楦邷剡^(guò)程能大幅減少質(zhì)粒的結(jié)合，從而減少抗性基因的水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)而削減抗性基因.那么可將厭氧消化作為畜禽糞便抗生素和重金屬抗性基因削減與控制的一項(xiàng)策略進(jìn)行深入探究，從“源頭”控制抗性基因.

　　堆肥廣泛應(yīng)用于有機(jī)固體廢棄物的處理，但目前有關(guān)堆肥過(guò)程中抗性基因分布特征的研究較少，缺乏堆肥工藝參數(shù)對(duì)抗性基因削減的研究.Zhu等(2013)調(diào)查了我國(guó)3個(gè)豬糞堆肥廠堆肥前后抗生素抗性基因豐度的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性基因豐度有的增加，有的減少，有的變化不明顯.Chen等(2007)研究了堆肥處理豬糞和氧化溝、生物濾池養(yǎng)豬廢水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堆肥后豬糞中各種紅霉素抗性基因均大幅減少，ermA、ermB、ermC、ermF、ermT、ermX分別減少了2.3 logs、5.7 logs、5.0 logs、4.3 logs、7.1 logs、7.3 logs，并且堆肥對(duì)各種四環(huán)素抗性基因具有相似的削減效果，這可能是由于通風(fēng)、高溫和固相中基因水平轉(zhuǎn)移的減少等共同作用導(dǎo)致了堆肥對(duì)抗性基因的有效削減.上述結(jié)果說(shuō)明工藝操作參數(shù)對(duì)抗生素抗性基因的削減至關(guān)重要，因此，迫切需要深入探究工藝操作參數(shù)的優(yōu)化對(duì)抗生素抗性基因削減的影響.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　7 結(jié)語(yǔ)和展望

　　盡管國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量的研究，但已有研究主要針對(duì)畜禽糞污、生物處理或土地利用的單一過(guò)程進(jìn)行，缺乏對(duì)畜禽糞污—生物處理—土地利用的全過(guò)程進(jìn)行考察，導(dǎo)致人們對(duì)全過(guò)程的抗生素和重金屬及其抗性基因的賦存與轉(zhuǎn)歸特征缺乏全面、系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，難以進(jìn)行全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，進(jìn)而難以提出有效的抗性基因污染削減與控制策略.例如，在全過(guò)程中，抗生素是如何一步步降解?哪一步是抗生素降解的關(guān)鍵步驟?全過(guò)程中重金屬形態(tài)的變化規(guī)律?復(fù)合污染條件下對(duì)抗性基因在全過(guò)程中的賦存與轉(zhuǎn)歸特征有何影響?如何在全過(guò)程中有效削減和控制抗生素抗性基因?現(xiàn)階段不僅抗生素和重金屬抗性基因在環(huán)境中復(fù)合分布特征的研究較少，而且非常缺乏在畜禽糞便生物處理過(guò)程中的賦存與轉(zhuǎn)歸特征、工藝參數(shù)對(duì)抗性基因削減、復(fù)合分布形態(tài)的影響等方面的研究.目前人們尚未對(duì)畜禽糞便中抗生素和重金屬抗性基因的控制和削減提出明確的策略和出臺(tái)相關(guān)的規(guī)定.針對(duì)以上情況，可在以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究：

　　1. 深入研究畜禽糞便生物處理及其土地利用全過(guò)程中抗生素抗性基因和重金屬抗性基因的分布特征及其影響因素，并對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.

　　2. 深入研究畜禽糞便生物處理及其工藝操作參數(shù)對(duì)抗生素、重金屬、抗生素和重金屬抗性基因、微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，尤其是高溫厭氧消化和堆肥工藝.

　　3. 加強(qiáng)畜禽養(yǎng)殖糞便風(fēng)險(xiǎn)控制與資源化利用的綜合管理研究，從源頭上削減抗生素和重金屬的使用量，進(jìn)而削減和控制抗性基因污染.

　　4. 從前端(飼料獸藥)、過(guò)程(糞污處理)和末端(土地利用)控制入手，研發(fā)適于全過(guò)程抗生素、重金屬及其抗性基因的協(xié)同控制關(guān)鍵技術(shù)，為控制和削減畜禽養(yǎng)殖糞污中抗生素、重金屬及其抗性基因提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐.