公布日：2023.09.22
申請日：2023.04.17
分類號：C12N1/21(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/53(2006.01)I;C12N15/55(2006.01)I;C12N1/36(2006.01)I;C02F3/34(2023.01)I;C12R1/19(2006.01)N;C02F101
/16(2006.01)N
摘要
本發明涉及污水處理與基因工程技術領域，具體涉及一種用于高氨氮廢水的基因工程菌及其構建方法。本發明基因工程菌保藏號為CCTCCNO：M2023301，保藏于中國典型培養物保藏中心。在基因工程菌中加載氨單加氧酶基因與脂肪酶基因，氨單加氧酶是硝化菌代謝過程中的關鍵酶，主要催化氨氮氧化形成羥胺，脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，能分解生物所產生的各種天然的油和脂肪，可降解污水中COD，氨單加氧酶基因協同脂肪酶基因，表達出氨單加氧酶與脂肪酶，實現高氨氮廢水中氨氮以及COD的去除。本發明基因工程菌在高氨氮廢水處理中COD去除率為94.02％～96.35％，氨氮去除率為93.62％～94.32％，脫氮、降解效果良好，同時廢水處理成本低、效率高、效果穩定、無污染，便于在高氨氮廢水處理中應用。
權利要求書
1.一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌具有如SEQIDNo.5所示的外源氨基酸序列，保藏號為CCTCCNO：M2023301，保藏于中國典型培養物保藏中心。
2.根據權利要求1所述的一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌中如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列由如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)和如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)基因融合獲得。
3.根據權利要求2所述的一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌中表達如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表達如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
4.根據權利要求1所述的一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的高氨氮廢水包括生活污水、工業廢水以及垃圾滲濾液。
5.根據權利要求1所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：1)獲得AMO(氨單加氧酶基因)-TLL5(脂肪酶基因)目的基因；2)將目的基因AMO-TLL5導入表達載體PET28a中獲得重組表達載體PET28a-AMO-TLL5；3)將重組表達載體PET28a-AMO-TLL5轉化到大腸桿菌BL21中，挑陽性克隆到LB培養基中過夜培養得到重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5；4)將重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5，在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高氨氮廢水能力的基因工程好氧硝化細菌；5)將該菌株投入到發酵培養基中擴大培養，而后投入污水中使用。
6.根據權利要求5所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于：所述的步驟1)中采用重疊PCR技術將AMO和TLL5融合表達。
7.根據權利要求5所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于：所述的步驟3)中LB培養基中抗生素的添加量為1‰，在37℃、200rpm搖床上培養10～12h。
8.根據權利要求5所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于：所述的步驟4)中高氨氮廢水中氨氮的濃度為400～600mg/L，COD濃度為600～650mg/L。
9.根據權利要求8所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于：所述的步驟5)中高氨氮廢水中COD的去除率為94.02％～96.35％，氨氮的去除率為93.62％～94.32％。
10.根據權利要求5所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于：所述的步驟5)中發酵培養基的配方為：每1L水中，硫酸銨1g，氯化鈉0.3g，七水硫酸亞鐵0.03g，七水硫酸鎂0.03g，三水磷酸氫二鉀1.3g，碳酸鈣5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g。
發明內容
本發明的目的是針對上述現有技術的不足，提供一種用于高氨氮廢水的基因工程菌及其構建方法，以解決天然的硝化細菌培養困難、在高氨氮廢水處理過程中硝化反應速率低以及脫氮效果不穩定的問題。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，所述的基因工程菌具有如SEQIDNo.5所示的外源氨基酸序列，保藏號為CCTCCNO：M2023301，保藏于中國典型培養物保藏中心。
進一步地，所述的基因工程菌中如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列由如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)和如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)基因融合獲得。
進一步地，所述的基因工程菌中表達如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表達如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
進一步地，所述的高氨氮廢水包括生活污水、工業廢水以及垃圾滲濾液。
上述基因工程菌的構建方法，包括以下步驟：
1)獲得AMO(氨單加氧酶基因)-TLL5(脂肪酶基因)目的基因；
2)將目的基因AMO-TLL5導入表達載體PET28a中獲得重組表達載體PET28a-AMO-TLL5；
3)將重組表達載體PET28a-AMO-TLL5轉化到大腸桿菌BL21中，挑陽性克隆到LB培養基中過夜培養得到重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5；
4)將重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5，在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高氨氮廢水能力的基因工程好氧硝化細菌；
5)將該菌株投入到發酵培養基中擴大培養，而后投入污水中使用。
進一步地，所述的步驟1)中采用重疊PCR技術將AMO和TLL5融合表達。
進一步地，所述的步驟3)中LB培養基中抗生素的添加量為1‰，在37℃、200rpm搖床上培養10～12h。
進一步地，所述的步驟4)中高濃度氨氮污水中氨氮的濃度為400～600mg/L，COD濃度為600～650mg/L。
進一步地，所述的步驟5)中高氨氮廢水中COD的去除率為94.02％～96.35％，氨氮的去除率為93.62％～94.32％。
進一步地，所述的步驟5)中發酵培養基的配方為：每1L水中，硫酸銨1g，氯化鈉0.3g，七水硫酸亞鐵0.03g，七水硫酸鎂0.03g，三水磷酸氫二鉀1.3g，碳酸鈣5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g。
本發明的有益效果：基因工程菌在高氨氮廢水處理中COD去除率為94.02％～96.35％，氨氮去除率為93.62％～94.32％，脫氮、降解效果良好，同時廢水處理成本低、效率高、效果穩定、無污染，便于在高氨氮廢水處理中應用。
（發明人：杜莉莉;藺洪永;包海花;張涵儀;謝佳）
