厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation,Anammox)與傳統脫氮技術相比有許多優點，如能耗低、污泥產量較少且無需外加碳源，常被用于處理高氨氮廢水。但Anammox過程會產生一定量的硝酸鹽，限制脫氮效果進一步提高。工業廢水，如焦化、石化、印染等，成分復雜毒性大，難以處理。這類工業廢水不僅含有NH4+-N，還存在甲酚、苯酚等有毒有機污染物。酚類化合物雖對細菌活性有一定的抑制作用，但可以作為電子供體用于反硝化反應。若能將2種工藝耦合，則可將氮素和有機物同步去除。周少奇等研究發現，Anammox反應產生的NO3−-N，可用于反硝化反應；而反硝化過程消耗有機物，從而減弱有機物對Anammox菌的抑制，理論上兩者可實現協同作用。近年來不少學者探究了苯酚對Anammox系列工藝的影響，LUO等將苯酚投加到Anammox系統中探究其抑制機制，結果表明，苯酚(0~300mg·L−1)對Anammox無顯著抑制作用，且苯酚激活了反硝化作用，總氮去除負荷(nitrogenremovalrate,NRR)提高了0.94kg·(m3·d)−1。而陳璇等在苯酚對Anammox顆粒污泥脫氮性能抑制作用的研究中發現：當苯酚濃度為50和150mg·L−1時，NH4+-N去除率分別降低了15.05%和24.35%。在Anammox系列工藝處理含酚廢水方面，一些學者也得到了不同的結果。WANG等采用分離式短程硝化-厭氧氨氧化工藝處理含酚廢水，在NH4+-N濃度為200mg·L−1、苯酚/NH4+-N質量比為0.5的條件下，COD去除率為92%，苯酚去除率達100%，總氮去除率(nitrogenremovalefficiency,NRE)為82.4%。而HE等采用含有苯酚和氨氮的廢水(氨氮150mg·L−1、苯酚50mg·L−1)，成功啟動單級短程硝化/厭氧氨氧化反應器，總氮和COD去除率僅為73.0%和79.5%左右。
顆粒污泥作為固定化微生物聚合體，具有結構致密、沉降性能好，對不利環境抵抗能力強等突出優勢。而胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances,EPS)是污泥的重要組成部分，很多特性都顯著影響污泥性能。ZHOU等通過接種絮狀及細小顆粒狀的Anammox污泥啟動厭氧氨氧化耦合異養反硝化(simultaneousanammoxanddenitrification,SAD)工藝，發現隨著負荷增大，污泥EPS增多粒徑增大，顆粒化逐漸明顯。LI等發現適量的有機碳源(<130mg·L−1)可提高Anammox顆粒污泥的EPS含量，從而提高污泥的沉降性能。LUO等在探究苯酚對Anammox工藝的影響時發現，隨著苯酚質量濃度從0增加到200mg·L−1，EPS含量從(251.50±13.88)mg·g−1逐漸增加到(411.10±11.64)mg·g−1，其中蛋白質(protein,PN)含量多且增幅大。EPS中PN和多糖(polysaccharide,PS)兩大組分在Anammox顆粒污泥的形成、運行中發揮重要作用，在不同反應器類型及氮負荷條件下，顆粒污泥的EPS含量與PN/PS存在顯著差異。
可見，在以往的研究中認為基于Anammox工藝并耦合硝化、反硝化等工藝處理含酚廢水是可行的，而以Anammox工藝為基礎，通過添加有機物為碳源啟動SAD工藝相對比較簡單快捷；但由于含酚廢水的有毒性、難降解性，采用該工藝處理含酚廢水鮮有報道；此外，有關酚類物質對污泥中EPS的成分、結構及其對顆粒污泥特性的影響尚無統一認識。鑒于此，本研究以實驗室已經啟動的Anammox系統為基礎，通過添加有機物及苯酚，探究SAD工藝啟動過程的脫氮除碳性能及污泥特性，以期為該耦合系統的穩定運行提供理論依據，這對該工藝的推廣運用以及處理含酚廢水具有重要指導意義。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置與流程
本實驗采用升流式厭氧污泥床(upflowanaerobicsludgebed,UASB)裝置，其工藝流程如圖1所示。反應器有效容積10L，外層設有水浴夾層，最外層包裹橡塑保溫材料，使溫度保持在(33±2)℃。反應器設有內循環，回流比控制在32.0%~48.0%；采用連續進水，水力停留時間(hydraulicretentiontime,HRT)為6.15h，上升流速為3.62m·h−1。
1.2 接種污泥
基于課題組前期穩定運行2個月的厭氧氨氧化UASB反應器，反應器內Anammox顆粒污泥量為1L，污泥質量濃度(mixedliquorsuspendedsolids,MLSS)為3462mg·L−1，MLVSS/MLSS比為0.46。
1.3 實驗運行條件
SAD工藝啟動共歷經6個階段。維持溶解氧(dissolvedoxygen,DO)在0.01~0.8mg·L−1左右，進水pH為7.8左右。采用NH4Cl和NaNO2模擬廢水，乙酸鈉和苯酚的COD當量值分別以0.78和2.383計算，具體運行條件由表1所示。
1.4 分析方法
1)水質及污泥性質分析。
COD、NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N、MLSS和MLVSS均按《水和廢水監測分析方法》(第4版)進行測定，選用紫光分光光度法測定苯酚濃度：取不同濃度苯酚的標準樣品10mL分別置于25mL比色管中，加入1mL，pH為9.4硼酸-氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液混勻，加入0.2mL，0.5%的2,6-二溴苯醌-4-氯亞胺乙醇液，搖勻放置20min，在600nm處測量吸光值，得到苯酚濃度與吸光度的標準曲線，將未知樣品吸光度值帶入標準曲線求得苯酚濃度。溶解性微生物產物(solublemicrobialproduction,SMP)和EPS采用熱處理法萃取：取50mL泥水混合物放入離心管中，在6000r·min−1下離心15min，上清液過濾后即為SMP，向離心管中加入與上清液等體積的質量分數為0.9%的NaCl溶液，搖勻后沸水浴1h，在6000r·min−1下離心15min，取上清液過濾即為EPS。其中SMP和EPS中PN采用考馬斯亮藍法測定，PS采用苯酚-硫酸法測定。粒徑分布采用篩分法。顆粒污泥采集：在各階段末期從1~5號及底部取樣口取等體積的泥水混合物，然后混合均勻。
2)脫氮貢獻率計算。
由于TN去除是Anammox和異養反硝化耦合作用的結果，其中NH4+-N去除是Anammox作用完成的，而NO3−-N去除是反硝化作用的結果。根據Anammox反應化學計量比(式(1))以及式(2)~式(6)計算，可推測Anammox和反硝化對TN去除的貢獻率。
式中：C1為NH4+-N去除量，mg·L−1；C2為NO2−-N去除量，mg·L−1；C3為NO3−-N生成量，mg·L−1；E1為Anammox反應脫氮貢獻率，%；E2為反硝化反應脫氮貢獻率，%。
3)三維熒光光譜(three-dimensionalexcitationemissionmatrixfluorescencespectroscopy,3D-EEM)分析。
取各階段末顆粒污泥萃取得到的SMP和EPS提取液，通過三維熒光光譜儀(日立F7100,日本)進行測定，激發波長(Ex)和發射波長(Em)200~550nm，間隔均為5nm，掃描速度為60000nm·min−1，結果數據采用Origin2021進行處理與分析。
4)傅里葉變換紅外(fouriertransforminfraredspectrometer,FT-IR)光譜分析。
取各階段末期反應器中的顆粒污泥，用去離子水沖洗3次后，在105℃下烘干后與KBr按1∶180壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀(IRAffinity-1S,日本島津公司)進行測定，結果數據采用Origin2021進行處理與分析。利用傅里葉自去卷積法對紅外光譜酰胺Ⅰ區(1600~1700cm–1)進行處理，并利用PeakFit計算二階導數譜和曲線擬合。
2、結果與討論
2.1 UASB-SAD工藝啟動過程中脫氮除碳性能
如圖2所示，根據進水COD及其中苯酚含量的變化，將SAD系統啟動過程分為6個運行階段。階段Ⅰ為Anammox的適應期，運行7d后出水穩定，NH4+-N、NO2−-N的去除率分別為95.07%、97.45%，總氮容積負荷(nitrogenloadingrate,NLR)和NRR分別為0.853kg·(m3·d)−1和0.71kg·(m3·d)−1，NRE為83.72%。C2/C1和C3/C1比值分別為1.34和0.26，符合厭氧氨氧化反應的特征理論值。
在階段Ⅱ，開始投加有機物，出水NH4+-N為8.40mg·L−1，去除率比上一階段下降了3.60%，說明投加有機物對Anammox產生抑制作用；但由于反應器內培養出反硝化菌，因此，NRE有一定的提升，在NLR基本不變的條件下，NRE可達90.74%，NRR為0.78kg·(m3·d)−1。相似地，LI等在探究COD對Anammox工藝的影響時，發現當COD為100mg·L−1時，NH4+-N和TN的去除率均達到90%以上。系統內有機物得到同步去除，COD去除率為88.58%，碳去除負荷(carbonremovalrate,CRR)達到0.32kg·(m3·d)−1。階段Ⅲ~Ⅵ，在保持COD不變的情況下，逐漸將乙酸鈉替換為苯酚。其中階段Ⅲ和階段Ⅳ，由于苯酚質量濃度還處于較低水平(分別為10、20mg·L−1)，對耦合系統的影響較小；2個階段共運行26d后，出水穩定，出水水質與階段Ⅱ相比無明顯變化。在階段Ⅳ末期，出水苯酚為2.45mg·L−1，去除率達88.19%，表明耦合系統對苯酚有一定的耐受性，且能夠高效穩定地處理低濃度含酚廢水。在階段Ⅴ，隨著苯第1期王朝朝等：含酚廢水SAD工藝的啟動及污泥特性93酚質量濃度提高對Anammox菌的抑制作用加強，NH4+-N去除率下降為84.92%，TN去除率為87.31%。而C3/C1比值為-0.027，即出水NO3−-N濃度低于進水，表明反硝化作用進一步加強。此階段COD和苯酚去除率也有所下降，分別為86.92%和85.98%。階段Ⅵ，進水有機物全部為苯酚，經過25d運行后，反應器出水穩定；出水NH4+-N、NO2−-N分別為16.41mg·L−1和12.33mg·L−1，相較于階段Ⅱ中完全以乙酸鈉為碳源，其去除率分別下降了10.92%和3.87%；TN和COD及苯酚去除率分別為84.78%、85.23%、84.09%，NRR和CRR為0.73kg·(m3·d)−1和0.31kg·(m3·d)−1。冀穎等以乙酸鈉為碳源啟動SAD工藝，在C/N比為0.5條件下，NRR可達1.75kg·(m3·d)−1，NRE為90.81%，而COD去除率僅79.19%。他們的實驗結果與本文差別較大，可能是由于乙酸鈉和苯酚對Anammox菌活性抑制強度不同，及反應器運行條件有差別引起的。
綜合來看，在各階段苯酚濃度提高后，出水水質波動較大，這是由于有機物及苯酚對Anammox菌有一定的抑制作用，導致功能菌活性下降；但由于本實驗接種污泥為Anammox顆粒污泥，其結構緊湊抗沖擊能力高，可以維持一個相對穩定的微環境，使得顆粒污泥內微生物較快適應復雜環境條件，因此碳、氮去除率很快就恢復至較高水平。先以乙酸鈉為碳源再逐步替換為苯酚，對微生物來說各階段過渡時外界環境變化較小，有利于馴化細菌，逐漸提高對苯酚的耐受性。
2.2 脫氮貢獻率分析
對Anammox和反硝化對TN去除的貢獻率分析結果如圖3所示。可見，隨著苯酚濃度升高，Anammox對TN去除的貢獻率由97.92%降低到81.66%，而反硝化對TN去除的貢獻率由2.08%上升到18.34%，說明在耦合系統中苯酚對Anammox菌的抑制作用更強。王猛等在探究石油煉化廢水中COD和毒性物質對厭氧氨氧化-反硝化細菌混培物的影響時，也同樣發現Anammox菌比反硝化細菌對石油煉化廢水的毒性作用更敏感。這是因為對于反硝化細菌來說，由于反應可以利用多種代謝途徑獲取能量，所以基質對細菌的影響相對較小，且反硝化菌的繁殖速度遠超過Anammox菌。從各階段2種細菌對TN去除率的貢獻來看，Anammox貢獻率始終>80%，且NH4+-N、NO2−-N的去除主要是由Anammox來完成的。因此，要保證耦合系統穩定運行，關鍵是保障Anammox菌的活性。
2.3 UASB-SAD工藝啟動過程中污泥特性
1)污泥表觀形態、污泥粒徑的變化。
如圖4所示，在階段Ⅰ，顆粒污泥主要為黑紅色和紅棕色。從階段Ⅲ起，在粒徑較大的顆粒污泥表面可以觀察到大量白色點塊，這是因為反硝化菌在顆粒污泥表面大量增殖。到階段Ⅵ，黑紅色顆粒污泥減少紅棕色污泥增多，整體顏色由深變淺。SAD啟動成功時，得到的污泥主要是一種Anammox菌外面包裹反硝化菌的顆粒污泥，以及少量的白色反硝化菌絮狀物。劉常敬等啟動SAD工藝得到的污泥形態呈顆粒狀，有Anammox顆粒污泥、苯酚反硝化顆粒污泥、Anammox菌外面包裹苯酚反硝化菌的顆粒污泥3種形式。這與本研究結果略有不同，主要歸因于進水苯酚濃度不同，氮負荷以及污泥濃度差別較大。
在SAD啟動過程中，粒徑處于1.5~2.0mm的顆粒污泥占比始終最大。由圖5可見，從階段Ⅰ到階段Ⅱ，污泥粒徑有所下降，2.5mm的顆粒污泥占比逐漸增大。隨著苯酚濃度的增加，顆粒污泥粒徑呈現增大的趨勢，這與之前的一些研究結果不同，CHEN等在評估有機物對Anammox顆粒污泥的影響時，發現COD為200mg·L−1實驗組顆粒污泥的機械強度和沉降性能降低，部分顆粒污泥解體。而劉常敬等以苯酚為碳源啟動SAD工藝得到的顆粒污泥直徑達3mm。這歸因于運行方式不同。本文采用逐步提高苯酚濃度的方式，系統內微生物有適應的過程，且COD及苯酚濃度較低，微生物為了保護自己不受低濃度有機碳源的影響，會分泌更多的EPS，使厭氧氨氧化顆粒污泥更容易粘附和聚集，導致粒徑顯著增大。
2)SMP與EPS的變化。
各階段的SMP和EPS含量及組成如圖6所示。可見，SMP含量由11.03mg·g−1增加到33.97mg·g−1，其中在階段Ⅰ~Ⅲ，進水苯酚濃度較低，對顆粒污泥影響較小，SMP含量無明顯變化；EPS含量始終大于SMP，且隨著苯酚濃度升高，呈現增多的趨勢，階段Ⅰ為20.57mg·g−1，到階段階Ⅵ增至58.84mg·g−1。這主要是因為在外部環境發生突變時，細菌為了確保自身生存，會產生大量的EPS，而EPS會在細胞間形成交聯網絡，避免顆粒污泥解體且強化完整性，從而避免毒性有害物質與細胞直接接觸，減少對細菌的損害。在SMP和EPS中，PS含量少且無顯著變化，而PN含量多且增幅大，表明PN是SMP和EPS的主要成分。與階段Ⅰ相比，投加有機物后SMP中PN/PS值有顯著提高，由5.73上升至12.32，而EPS中PN/PS值由8.29上升至13.94。在階段Ⅲ(苯酚20mg·L−1)之前SMP、EPS及其PN/PS增幅均較小，推測與苯酚濃度有關，劉常敬等認為當苯酚濃度為18.8mg·L−1時，Anammox與反硝化耦合效果最好。PN含量的增加及PN/PS的增高使污泥疏水性增加，從而使微生物細胞更易于從水相中脫離出來，其受水中苯酚毒性的抑制作用也將得到有效緩解。
2.4 顆粒污泥3D-EEM分析
各階段顆粒污泥中SMP和EPS的3D-EEM圖譜如圖7所示。在SMP的EEM圖譜中存在2種特征熒光峰A和B，對應的Ex/Em分別在280nm/330nm、230nm/330nm，其中，A峰為色氨酸類蛋白質物質，B峰為酪氨酸蛋白類物質。EPS與SMP的EEM圖譜相似，同樣存在2個熒光峰A和B，熒光峰位置與SMP的EEM圖譜有略微區別，分別位于Ex/Em=275nm/320~350nm、Ex/Em=220~230nm/330nm。這主要是因為，EPS中峰A和峰B的熒光強度和峰面積遠大于SMP。隨著苯酚濃度的增大，Anammox菌和反硝化菌在受到毒性刺激，會釋放更多分泌物，從而維持污泥形態和性狀，這也是導致A、B峰強度提升的主要原因。在SMP和EPS的EEM圖譜中均出現了色氨酸蛋白類熒光峰與酪氨酸蛋白類熒光峰，且隨著苯酚濃度升高其對應的熒光峰強度增大，說明這2類物質在SMP和EPS中含量較多，可能在抵抗苯酚毒性及保持顆粒污泥完整起到了重要作用。ZHU等通過比較絮凝體和顆粒污泥中EPS的成分，發現芳香族蛋白物質和色氨酸類物質是顆粒污泥中EPS的關鍵成分，在維持顆粒污泥結構穩定發揮了重要作用。
2.5 顆粒污泥的FT-IR及其蛋白質二級結構分析
如圖8所示，各階段顆粒污泥的紅外圖譜相似。在3456cm–1處有一強吸收峰，主要是由蛋白質類和多糖類物質N—H和O—H伸縮振動引起；在2927cm–1處存在1個較弱的吸收峰，為脂肪類有機物中C—H反稱伸縮振動所致；2365cm–1處吸收峰可能由CO2引起。1645cm–1處的強烈吸收帶是由蛋白質酰胺I區的C＝O和C＝C拉伸振動引起的，1382cm–1處峰與酰胺Ⅱ區O—C—O對稱拉伸有關；1275cm–1附近的吸收峰是由蛋白質酰胺Ⅲ區C—N伸縮振動引起的。1081cm–1處的吸收峰主要與C—O—C伸展振動有關，是多糖物質的特征峰。值得關注的是，隨著苯酚濃度增大，1275cm–1和1081cm–1處的波峰強度變化不明顯，而在1645cm–1和1382cm–1處的波峰強度逐漸增大，表明蛋白質酰胺I區的C＝O和C＝C伸縮振動、酰胺Ⅱ區的O—C—O對稱拉伸峰有所增強，這種變化與SMP、EPS中PN的含量變化相一致。FT-IR分析結果進一步證實了EPS中PN含量的增加是顆粒污泥穩定的關鍵因素。
蛋白質二級結構的相對含量與其親/疏水性密切相關，并對污泥的吸附和聚集能力有重要影響，在蛋白質二級結構的研究中，常使用紅外光譜酰胺I區域作為研究對象，分析結果如圖9所示。表2呈現了4種主要蛋白質二級結構的相對含量。可見，隨著苯酚濃度的升高，顆粒污泥EPS中蛋白質二級結構的相對含量發生了變化，其中β-折疊和無規則卷曲的占比逐漸增大。通常用α-螺旋/(β-折疊+無規則卷曲)比值來評估蛋白質的親疏水性。楊明明等發現蛋白質二級結構α-螺旋/(β-折疊+無規則卷曲)比值由0.60逐漸降低到0.43，污泥表面疏水性由54.2%提高到63.1%。在本研究中，各階段顆粒污泥的α-螺旋/(β-折疊+無規則卷曲)比值從0.498逐漸下降到0.415，進一步證實顆粒污泥蛋白質疏水性升高。
3、結論
1)在苯酚質量濃度為37.77mg·L−1，平均NLR為0.85kg·(m3·d)−1的條件下，UASB-SAD反應器能長期穩定運行，且對TN和苯酚有較高的去除率，分別為84.78%和84.09%；Anammox在耦合系統中起主導作用，對NRE的貢獻率始終大于80%。
2)啟動過程中主要形成一種在Anammox菌外面包裹反硝化菌的顆粒污泥，污泥粒徑增大；SMP和EPS中PN含量多且增幅大，PN/PS比值增大，顆粒污泥疏水性增強。
3)FT-IR和蛋白質二級結構分析進一步表明，PN含量的增加是污泥疏水性增大的關鍵因素；3DEEM分析結果表明，色氨酸和酪氨酸類物質是顆粒污泥中SMP、EPS的關鍵成分，在抵抗苯酚毒性時發揮了重要作用。（來源：河北省水污染控制與水生態修復技術創新中心，邯鄲市水利用技術重點實驗室，河北工程大學能源與環境工程學院）
