目前，高鹽廢水是水處理領域的一大難點，電滲析、焚燒法、膜分離法、蒸汽壓縮法等均有一定的處理效果.但此類方法的投資運行費用較高，易造成二次污染而難以在實際生產過程中推廣應用.生化法因處理費用較低、應用范圍廣且不易造成二次污染而被廣泛利用.常用的生物法包括傳統活性污泥法、SBR法、MBR法、好氧顆粒污泥法以及厭氧生物處理法等.系統中適量的無機鹽不僅促進微生物生長過程中的酶反應，還能夠維持膜平衡、調節滲透壓.但鹽度一旦過量，就會對微生物的生長起到抑制作用，甚至會致使微生物死亡，其主要原因在于：廢水鹽度較高時會使微生物的滲透壓升高，使微生物脫水導致細胞原生質分離;鹽度較高時會使細胞脫氫酶的活性降低;廢水中的Cl-會對微生物有毒害作用，甚至會殺死微生物;使得水的密度增加，造成活性污泥上浮而流失.
國內外很多研究表明，生物法可以高效地處理高鹽度廢水.但隨著系統鹽度的增加，微生物需要一段時間的適應過程.系統鹽度的變化會引起微生物代謝途徑的變化以及微生物群落的顯著變化.本文通過逐漸提高系統的鹽度，探究不同鹽度下活性污泥的性質以及微生物群落的變化，并測定不同鹽度下活性污泥中微生物的脂肪酸和DNA，對處理實際的含鹽廢水有較大的意義.
1 材料與方法1.1 污泥來源與試驗材料1.1.1 污泥來源
試驗選取青島李村河生活污水處理廠二沉池污泥，在光學顯微鏡下對活性污泥進行觀察，視野中觀察到變形蟲、草履蟲等微型后生動物、原生動物等，表明現階段污泥的活性較高.
1.1.2 主要試劑和試驗儀器
氯化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸銨、乙酸、氫氧化鉀、納米四氧化三鐵、甲基叔丁基醚以及測定氨氮的相關試劑等. COD測定儀、可見分光光度計、臺式離心機、脂肪酸鑒定系統等.
1.2 耐鹽菌的馴化
試驗選取李村河污水處理廠二沉池污泥，按污泥:水=1:1的比例配成12 L活性污泥溶液于容器中，每日投加碳源、氮源、磷源分別為：葡萄糖12 g，硫酸銨1.42 g，磷酸二氫鉀0.344 g.間歇曝氣，每4 h一個周期，曝氣3 h，停歇1 h.每天換水一次，投加無碘鹽逐步提高系統的鹽度，使其鹽度從最開始的0，逐漸提升至0.5%、1%、1.5%、2%.每個鹽度下分別對活性污泥的活性和降解COD、NH4+-N性能進行測定，探索不同鹽度下活性污泥的污泥體積指數SVI的變化規律，同時提取出污泥中微生物的脂肪酸進行分析，得出耐鹽馴化過程中活性污泥系統微生物菌群的變化.
1.3 微生物脂肪酸的提取、分析
依據微生物脂肪酸的提取步驟，提取所需微生物的脂肪酸，運用MIDI-Sherlock全自動微生物鑒定系統進行菌群的鑒定分析.
1.4 高效降解含鹽結晶紫廢水活性污泥的馴化
取結晶紫粉末于3L燒杯中加蒸餾水，制成2 500 mL質量濃度為5 mg·L-1的模擬染料廢水.最初向燒杯中加入50 mL 5 mg·L-1的結晶紫廢水，燒杯中加入500 mL活性污泥溶液，加水定容至3 000 mL，曝氣馴化培養一周，然后每周逐漸多加200 mL結晶紫廢水，共馴化10周，得到可以高效降解含鹽結晶紫廢水的活性污泥.
1.5 四氧化三鐵磁納米粒子(MNPs)馴化含鹽結晶紫廢水中的活性污泥
將馴化好的500 mL活性污泥放入3 000 mL燒杯中，加入2 500 mL質量濃度為5 mg·L-1的模擬染料廢水，再向燒杯中加入0.57 g四氧化三鐵磁納米粒子(MNPs)，攪拌，曝氣培養8周，即得到試驗所需微生物，用于后續的DNA測序分析.
1.6 微生物DNA的提取、分析
本試驗采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒直接提取活性污泥中微生物的DNA，得到高品質的DNA可直接進行PCR擴增，利用高通量測序技術，研究不同鹽度下微生物群落的變化情況.
PCR儀：ABI GeneAmp® 9700.
測序平臺：采用Illumina MiSeq/HiSeq測序平臺，不同樣品的Tags和OTU數目統計，OUT豐度聚類圖，為了研究樣品的物種組成及多樣性信息，對所有樣品的全部Effective Tags序列進行聚類(默認選取Identity為97%)，形成OTU.
2 結果與討論2.1 不同鹽度下活性污泥對廢水COD、NH4+-N的降解
馴化初期系統鹽度為0%，由于污泥在容器中處于缺氧環境，活性較差COD去除率僅為55%左右. a階段(0~20 d)是系統在鹽度為0條件下的污泥馴化階段，20 d時COD和NH4+-N的去除率分別提高至80%和71%;b階段(20~50 d)是系統在鹽度為0.5%條件下的污泥馴化階段，COD、NH4+-N降解效率先下降后升高，馴化30 d后，COD和NH4+-N的去除率可提高到90%和78%;50d開始將系統的鹽度提高到1%，此時進入c階段(50~120 d)，馴化至120 d時污泥COD去除率達85%以上，NH4+-N的去除率在80%左右;120 d后進入d階段，此時系統的鹽度為1.5%，此鹽度下馴化維持60 d，COD去除率達到78%左右，NH4+-N去除率75%;180 d繼續提高系統鹽度至2%，系統進入e階段(180~300 d)，COD、NH4+-N的降解效率下降明顯，190 d時，COD去除率低至60.5%，NH4+-N去除率56%，保持鹽度2%繼續馴化，最終在300 d時測得COD去除率為80%左右，NH4+-N去除率75%，達到預期處理效果，如圖 1所示.
圖 1 COD、NH4+-N降解趨勢
系統鹽度每提高一次，污泥對有機物和氨氮的去除效率總是先下降后逐漸恢復的趨勢.鹽度提高，微生物細胞的滲透壓增高，細胞脫氫酶的活性降低，導致活性污泥系統受到沖擊，部分微生物由于無法適應高鹽環境，甚至出現死亡現象，使得處理效果減弱，表現為COD、NH4+-N的去除率下降.隨著長時間的不斷馴化，系統抗鹽度沖擊的能力逐漸增強，適應高鹽環境的微生物群落開始不斷生長繁殖，對COD、NH4+-N的降解效率提高.
2.2 不同鹽度下活性污泥SVI值的變化
由表 1和圖 2可知，隨著鹽度的增加，接種時活性污泥的濃度為3.50 g·L-1，經過300 d馴化后，在系統2%的條件下，活性污泥的濃度增加到7.52 g·L-1，而活性污泥的污泥體積指數SVI值不斷減小.在無鹽的環境中，污泥的SVI值在89 mL·g-1，在鹽度0.5%的環境中，污泥的SVI值下降到53 mL·g-1，隨著鹽度的不斷增加，當鹽度為2%時，污泥的SVI值不足35 mL·g-1.隨著鹽度增加，活性污泥SVI值降低，可能是由于：高鹽環境下微生物的生長和生物活性均受到抑制，微生物從絮凝體上脫落上浮水中，無法沉降;鹽度的沖擊改變了污泥的生態環境，游離原生微型后生動物的捕食受到影響而死亡，污泥沉降性減弱;高鹽沖擊使微生物生理活動受阻，胞外分泌物減少，污泥的絮凝性能下降.而有研究認為高鹽環境下，微生物為了生存聚集在一起，通過自身調節使胞外多聚物的分泌增加，既可以抵御鹽度的毒害又增加了絮凝性能，表現為絮體顆粒變大密實，改善了沉降性能.
表 1 各鹽度下活性污泥SV、MLSS、SVI的變化
圖 2 各鹽度下SVI值
2.3 不同鹽度下活性污泥中微生物的脂肪酸分析
利用MIDI-Sherlock全自動微生物鑒定系統對各個鹽度所提取出的脂肪酸進行分析，得到各種脂肪酸分布圖譜.將5個鹽度下脂肪酸鑒定圖譜中各菌群所占含量用Origin軟件處理并整理得到圖 3.
圖 3 對應鹽度下各菌群所占百分比
從活性污泥微生物的組成來看，主要由AM菌、革蘭氏陰性菌、真核生物、放線菌、革蘭氏陽性菌和厭氧菌等組成.隨著鹽度的升高，革蘭氏陽性菌數量表現為先增加后減小，其中在鹽度為1%時含量最高，為47%，整個鹽度梯度革蘭氏陽性菌含量均維持在35%以上;而革蘭氏陰性菌所占百分比隨著鹽度的增加，表現出明顯下降的趨勢，從百分含量45%左右減小到10%左右;真菌和放線菌隨著鹽度的升高百分含量均有一定程度上增加，其中真菌的增加幅度較為明顯，從5%左右升高到30%，放線菌百分含量由5%增加到15%左右;圖 3中看出真核生物的百分含量隨鹽度變化不大，在5%左右波動;AM菌和厭氧菌在活性污泥微生物群落中所占比例很小，約為5%，隨著鹽度的增加，百分含量下降，鹽度1%以上百分含量基本為0%.
革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，肽聚糖含量豐富，并且含有大量的磷壁酸，這種結構使其可以抵抗較高的鹽度沖擊，因此革蘭氏陽性菌是每個對應鹽度下的優勢菌種;革蘭氏陰性菌細胞壁以及肽聚糖膜要比革蘭氏陽性菌要薄得多，因此隨著鹽度的增加，革蘭氏陰性菌越來越少;真菌和放線菌中含有大量的累積相容性物質，如糖類、醇類、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等，可大大提高耐鹽性，使其隨著鹽度的增加含量逐漸增大.因此，隨著不斷的馴化，污泥在高鹽環境中的活性良好，可高效地處理廢水.
2.4 模擬染料廢水降解趨勢
向馴化好的活性污泥中加入質量濃度為5 mg·L-1的結晶紫染料廢水，曝氣培養，每隔12 h取樣一次，并于紫外-可見光分光光度計上進行波長掃描，掃描出的數據用Origin軟件繪圖，結果如圖 4.從中可以看出，結晶紫在582 nm處有最大吸收峰，在301 nm處有吸收峰. 0 h最大吸收峰處的吸光度值為1.136，12 h最大吸收峰處的吸光度值為0.791，24 h最大吸收峰處的吸光度值為0.274，分別代入標準曲線計算得出結晶紫的濃度分別為5、3.45、1.16mg·L-1.可以直觀地看出結晶紫濃度隨時間逐漸降低，驗證了經高鹽結晶紫模擬廢水馴化的活性污泥對結晶紫具有顯著的降解能力.
圖 4 結晶紫吸收峰變化
2.5 16S rDNA測序分析結果
對耐鹽馴化階段的活性污泥(鹽度分別為0.5%、1%、1.5%、2%)以及高鹽結晶紫染料馴化階段的污泥和MNPs馴化出的功能微生物進行DNA提取并對提取出的DNA進行16S rDNA測序分析.
DNA檢測合格后(濃度>ng·μL-1)，用一對特異性引物(515F、806R)對16S rDNA的V4區進行PCR擴增，電泳結果如圖 5.從中可以看出PCR擴增的條帶清晰，大小合適，產物純度較高，且無雜帶，可以進行DNA測序分析.
圖 5 活性污泥細菌16S rDNA基因的PCR產物
由圖 6可以看出樣品A-0.5、A-1、A-1.5、A-2中OUT數目分別為600、300、420、160，隨著鹽度的不斷增加，微生物群落的生長受到不同程度的抑制，致使微生物的多樣性逐漸降低.圖 7中橫向為樣品信息，縱向為OTU ID，其中左側的聚類樹為OTU的系統發生關系及其物種注釋，分支的顏色表示OTU所在的屬(右邊的圖例)，上方的聚類樹為樣品聚類樹，中間的熱圖是OTU的相對豐度熱圖，顏色與相對豐度的關系見圖 7中的刻度尺.從中可以看出，隨著鹽度的不斷增加，酸胞菌屬(Acidocella)、麗水菌屬(Winogradskyella)、產黃桿菌(Rhodanobacter)、紅菌(Parvibaculum)含量均有不同程度的升高，并且產黃桿菌(Rhodanobacter)成為優勢菌種;而變形菌屬(Dechloromonas)、黃色單胞菌(Dokdonella)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、海藻球菌屬(Phycicoccus)含量呈下降趨勢，體現了微生物群落隨系統的鹽度逐步演變的過程.
樣品編號A-0.5、A-1、A-1.5、A-2、B-2、C-2分別對應鹽度為0.5%、1%、1.5%、2%活性污泥樣品、結晶紫馴化活性污泥樣品和MNPs馴化出的功能微生物樣品，下同
圖 6 不同樣品的Tags和OTU數目統計
圖 7 OUT豐度聚類圖
將樣品B-2(鹽度2%的條件下加入結晶紫染料的活性污泥樣品)與A-2(鹽度2%的活性污泥樣品)對比發現：紅細菌屬(Parvibaculum)、麗水菌屬(Winogradskyella)含量有所增加，而產黃桿菌(Rhodanobacter)、農桿菌屬(Agrobacterium)含量降低，說明紅細菌屬(Parvibaculum)、麗水菌屬(Winogradskyella)能以結晶紫染料為能源物質，將其分解為其他小分子物質，一方面用于自身的生長代謝，另一方面用于細胞的增殖，使得菌屬的含量升高;結晶紫染料不能作為能源物質被產黃桿菌(Rhodanobacter)、農桿菌屬(Agrobacterium)所利用，致使沒有可以維持其自身生長代謝的物質，從而使得該菌屬的數量不斷降低.
將樣品C-2(加入MNPs的結晶紫-活性污泥樣品)與樣品B-2對比可以看出：酸胞菌屬(Acidocella)、產黃桿菌(Rhodanobacter)含量增加，其原因是由于加入的MNPs有效地提高了污泥抗有毒有害物質沖擊的能力，并且MNPs可作為微生物生長棲息的載體，提高了酸胞菌屬(Acidocella)、產黃桿菌(Rhodanobacter)的生物活性，便于其生長繁殖，使其含量增加;紅細菌屬(Parvibaculum)、農桿菌屬(Agrobacterium)含量減小，可能由于MNPs的加入改變菌屬的生物磁場以及四氧化三鐵對該菌屬的微毒性，影響其新陳代謝等生命活動，導致數量下降.具體參見污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關技術文檔。
3 結論
(1) 系統的鹽度顯著影響活性污泥的活性和沉降性能，隨著鹽度的增加，系統對廢水COD、NH4+-N的去除率以及SVI值均有所降低.經過一定時間馴化后，在系統鹽度在2%的條件下，COD和NH4+-N的去除率基本穩定在80%和75%左右，SVI值從開始的89 mL·g-1下降到34 mL·g-1.
(2) 隨著系統鹽度的增加，革蘭氏陰性菌優勢菌種的位置逐漸被真菌和放線菌取代，而革蘭氏陽性菌依然為優勢菌種;鹽度對真核生物的生長影響不大，對AM菌和厭氧菌起到抑制作用.
(3) 馴化后的活性污泥可較好的處理含鹽結晶紫廢水，經24 h生化處理，結晶紫廢水的降解率可達76.8%.
(4) 隨著鹽度的增加微生物的多樣性逐漸減少，其中酸胞菌屬、麗水菌屬、產黃桿菌、紅菌含量升高，產黃桿菌成為優勢菌種，變形菌屬、黃色單胞菌、硝化螺菌屬含量下降.
(5) 加入結晶紫染料的活性污泥中紅細菌屬、麗水菌屬含量有所增加，產黃桿菌、農桿菌屬含量減小.加入MNPs的結晶紫-活性污泥中酸胞菌屬、產黃桿菌含量增加，紅細菌屬、農桿菌屬含量減小.
