氨氧化細菌( ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和亞硝酸鹽氧化細菌( nitrite-oxidizing bacteria,NOB)統稱為硝化細菌,是實現生物硝化過程的功能微生物。 首先由 AOB 將 NH +4 氧化為 NO -2 完成亞硝化,之后由 NOB 將 NO -2 氧化至 NO -3 ,完成全部硝化過程,第一步被稱為短程硝化,較之于全程硝化可節約 25% 的氧氣消耗。 實際中因運行條件所限,短程硝化難以維持,亞硝化反應生成的 NO -2 很快被氧化為NO -3。目前我國污水處理廠普遍采用活性污泥工藝進行生物脫氮,但普遍面臨硝化速率較低、低溫季節尤為嚴重的問題。 因污水中硝化細菌濃度和硝化速率成正比,且硝化速率直接影響污水處理工藝的處理效果,為此,一些研究人員采用添加載體填料、細胞固定化生物活性填料或生物添加等方式增加反應器內硝化細菌濃度,以提高硝化反應速率。
已有研究報道,研究人員采用選擇性培養基從污水處理反應器中成功分離出具有較高硝化能力的硝化細菌菌株,試圖通過擴大培養以提高污水處理硝化速率;但是純種細菌生態系統脆弱,對實際污水的適應能力較差,而復合菌群因具有生物多樣性而更具優勢。本研究以篩選和富集硝化細菌菌群并且實現高氨氮氧化能力為目標,以此為基礎,重點考察了 pH 值和硝化細菌濃度對氨氮氧化速率的影響,以期為實際中提升氨氮污廢水處理的氨氮氧化速率提供理論指導。
1 材料與方法
1. 1 實驗裝置和原水
本研究采用一內徑為 16 cm,高度為 50 cm 的細菌發酵罐( Labfors,INFORS 公司,瑞士)為實驗裝置,有效容積為 6 L,上部為圓柱形,底部為半球狀。 采用穿孔管曝氣,氣體流量計調節曝氣量控制溶解氧(DO)濃度;溫度傳感器在線監測反應器內水溫的變化,控制溫度(28 ± 1)℃;攪拌轉速 100 r·min - 1;由蠕動泵自動加堿(Na2CO3 和 NaHCO3 )調節 pH、補充堿度并作為碳源;反應器上方設置一取樣口,用于取樣、進水、虹吸排水和測定溶解氧。
接種污泥取自北京高碑店污水處理廠 A2/ O 工藝回流污泥。 原水采用人工配水,由高濃度基礎液和去離子水配制成預期濃度,其中 NH +4 -N(NH4Cl)濃度隨反應速率升高而逐漸提高,其他水質指標平均值約為:PO3 -4 -P(KH2 PO4 和 K2HPO4·3H2O) 20 mg·L - 1,MgSO4·7H2O 30 mg·L - 1,CaCl2 15 mg·L - 1,FeSO4·7H2O 30 mg·L - 1,NaCl 20 mg·L - 1,微量元素 1 mL·L - 1。 成分:ZnSO4·7H2O 0. 5 g·L - 1,MnCl2·4H2O 0. 5 g·L - 1,CoCl2·6H2O 0. 4 g·L - 1,CuSO4·5H2O 0. 4 g·L - 1,NiCl2·6H2O 0. 2 g·L - 1,Na2MoO4·2H2O 0. 05 g·L - 1,EDTA 1 g·L - 1。
1. 2 實驗方法
采用間歇方式運行,每天運行 2 周期,每周期分為進水、反應、污泥沉淀、排水 4 階段。 好氧反應 DO初始范圍 1. 2 ~ 2. 5 mg·L - 1,pH 值范圍 6. 8 ~ 7. 7。 運行近 1 個月以篩選和富集硝化細菌菌群。
此外,考察 pH 值對氨氮氧化速率的影響。 有效容積 6 L,盡管在硝化細菌篩選和富集培養期間,NOB活性受到一定程度抑制,表現為較低初始游離氨( FA)濃度下,間歇式反應 NH +4 -N 氧化過程中產生亞硝酸鹽積累;但以此為相同背景,反應全程 pH 值分別為 6. 5 ± 0. 1、7. 0 ± 0. 1、7. 5 ± 0. 1 和 8. 0 ± 0. 1,由自動加堿裝置調節 pH 以保持初始水平,采用間歇運行方式,各組實驗初始 NH +4 -N 濃度和 DO 水平均分別控制在65 mg·L - 1和 2. 5 mg·L - 1左右。 間歇運行時間以保證 NH +4 -N 盡可能氧化完全為宜。 因 NH +4 -N 氧化接近結束時 DO 升高導致菌體自身氧化分解,因此系統污泥濃度(MLSS)有所減少。
在此基礎上,考察細菌濃度對氨氮氧化速率的影響。 通過沉淀排水保留污泥,之后進水至 3 L,相當于反應有效容積縮小 50% ,污泥濃度(硝化細菌濃度)提高 1 倍,反應全程 pH 值為 7. 3 ± 0. 1,初始 NH +4 -N濃度和 DO 水平同 pH 影響實驗。
1. 3 測定方法
進行化學分析前,樣品先采用中速定性濾紙過濾。 分析項目 NH +4 -N、NO -2 -N、NO -3 -N 濃度和 MLSS 按照國家環境保護總局規定的標準方法測定。 DO 濃度采用 WTW Oxi315i 溶解氧儀進行測定。 游離氨( free ammonia,FA)濃度按式(1)計算：
式中:FA 為游離氨濃度,mg·L - 1;[NH +4 -N]表示 NH +4 -N 濃度,mg·L - 1;T 為溫度,℃。
以一定反應時間內開始和結束時 NH +4 -N 濃度減少量計算氨氮氧化速率,按式(2)計算:
式中:AOR 為氨氮氧化速率,mg·( L·h) - 1;[NH +4 -N]表示 NH +4 -N 濃度,mg·L - 1;t 表示反應時間,h。
由于實驗過程中每周期換水后系統剩余少量 NO -2 -N、NO -3 -N,因此以每周期反應開始和結束時 NO -2 -N 和 NO -3 -N 濃度計算生成量,以評價亞硝酸鹽積累率,按式(3)計算:
式中:[NO -2 -N] 開始為反應初始 NO -2 -N 濃度,mg·L - 1;[ NO -2 -N] 結束為反應結束 NO -2 -N 濃度,mg·L - 1;[NO -3 -N] 開始為反應初始 NO -3 -N 濃度,mg·L - 1;[NO -3 -N] 結束為反應結束 NO -3 -N 濃度,mg·L - 1。
注:若生成量為負值,則按零計算。
1. 4 熒光原位雜交(FISH)分析
采用熒光原位雜交( fluorescence in situ hybridization,FISH)技術對培養后的活性污泥中 AOB、NOB和總細菌進行檢測,以考察硝化細菌菌群篩選和富集效果,所用探針序列見表 1。 并采用 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡對雜交后的每個污泥樣品隨機拍攝 10 ~ 20 張照片,之后用 Image-Pro Plus 6. 0 軟件對種群數量進行分析。
注:1) EUBmix 由 EUB338、EUB338II 和 EUB338Ⅲ按摩爾濃度比1 ∶ 1 ∶ 1 混合組成,其甲酰胺濃度( FA)不受限制,可遵循另一種目標探針的甲酰胺濃度,本研究遵循 NIT3 為 40% 。
表 1 FISH 分析中采用的探針序列、目標細菌和熒光標記
2 結果與討論
2. 1 硝化細菌菌群篩選和富集效果
為快速實現硝化細菌菌群的篩選和富集,本研究溫度設定為 28 ℃ 左右利于硝化細菌生長。 實驗第 1 天采用間歇運行方式考察接種污泥的氨氮氧化速率約 15 mg·( L·h) - 1,為全程硝化污泥,接種污泥濃度 3 784 mg·L - 1。 培養近 1 個月時,采用間歇式運行,pH 為 7. 3 ± 0. 1,第 1 小時氨氮氧化速率達到 47. 21 mg·( L·h) - 1,是接種污泥的 3 倍多,如圖1 所示。 然而污泥濃度相對于啟動初期明顯降低。由此可以反映出,在此期間硝化細菌在適宜的運行條件下得以大量生長,且活性污泥中其他細菌逐漸被淘洗出反應器,從而硝化細菌的濃度升高,成為優勢菌群。
2. 2 pH 值對氨氮氧化速率、亞硝酸鹽積累和硝酸鹽生成的影響
在硝化細菌篩選和富集期間,發現 pH 波動對氨氮氧化速率產生明顯影響,為此重點考察 pH 值對氨氮氧化速率的影響,初始 DO 濃度均控制為 2. 5 mg·L - 1左右以排除低溶解氧導致亞硝酸鹽積累。 結果如圖 2 所示,pH 分別為 6. 5 ± 0. 1、7. 0 ± 0. 1、7. 5 ± 0. 1 和 8. 0 ± 0. 1 時,NH +4 -N 由 65 mg·L - 1左右至基本反應完全,時間分別為 5 h、3 h、2 h 和 100 min,反應結束時,亞硝酸鹽積累率分別為 0、0、23. 65%和 55. 29% 。
通過觀察各 pH 值下氨氮氧化時間和亞硝酸鹽積累的變化,分析 pH 對氨氮氧化速率和亞硝酸鹽積累影響的原因,主要包括以下 2 個方面: 1) pH 影響硝化細菌的生長;2) pH 影響 FA 水平,進而影響 NOB的活性。 研究表明,微生物的生長繁殖與所處環境的 pH 值密切相關,不同微生物生長所需的最佳 pH 范圍有所差異,普遍認為,適宜 AOB 生長的 pH 范圍為 7. 0 ~ 8. 5,NOB 為 6. 0 ~ 7. 5;因此,pH 處于 6. 5 的低水平下,對 AOB 的生長產生不利影響,氨氮氧化速率明顯減慢,進而影響硝化第 2 步反應速率,導致整個硝化過程反應速率較慢。 而 pH 處于8. 0 的高水平下,利于 AOB 生長,氨氮氧化速率加快。 由此可以說明在適當范圍內,pH 值升高利于提高氨氮氧化速率。
此外,游離氨( FA)對硝化細菌的活性產生抑制作用,且 AOB 比 NOB 承受 FA 的抑制能力更強,其抑制作用的閾值一般在 10 ~ 150 mg·L - 1和 0. 1 ~ 1. 0 mg·L - 1。 根據公式(1) ,提高 pH 值,FA 水平隨之提高,達到對 NOB 產生抑制作用的閾值范圍,即產生亞硝酸鹽積累,且 NOB 抑制程度與 FA 水平呈正相關。 以本實驗 NH +4 -N 濃度65 mg·L - 1、溫度28 ℃、pH 分別為 6. 5、7. 0、7. 5 和8. 0 計,采用公式(1)計算得 FA 濃度,結果如表 2 所示。
表 2 不同 pH 下的游離氨(FA)濃度
在圖 2( a)中,pH 值為 6. 5 時,初始 FA 濃度為0. 17 mg·L - 1,相對于 NOB 的抑制作用閾值 0. 1 ~1. 0 mg·L - 1處于較低水平,基本未對 NOB 產生抑制,硝化反應第 1 步生成的 NO -2 -N 幾乎同步轉化為NO -3 -N,反應過程中幾乎無 NO -2 -N 積累,NO -2 -N 曲線基本呈水平狀態,屬于全程硝化。
在圖 2( b)中,pH 值為 7. 0 時,初始 FA 濃度為0. 55 mg·L - 1,對 NOB 產生一定程度的抑制。 反應開始前 60 min,FA 抑制作用明顯,NO -2 -N 濃度逐漸上升,但 NO -3 -N 濃度高于 NO -2 -N 濃度,第 60 分鐘時,NO -2 -N 積累量達到最高值 15. 20 mg·L - 1。 此后著反應的進行,NH +4 -N 濃度降低,FA 隨之降低,對 NOB 的抑制作用逐漸減弱,氨氮完全氧化時,NO -2 -N部氧化為 NO -3 -N,整個反應過程仍屬于全程硝化。
在圖 2( c)和( d)中,pH 值 7. 5 和 8. 0 時,初始 FA 濃度分別達到 1. 72 mg·L - 1和 5. 18 mg·L - 1,NOB 抑制作用較強,NO -2 -N 峰值在 90 min 和 75 min 時分別達到 31. 16 mg·L - 1和 39. 11 mg·L - 1,pH高,NO -2 -N 峰值越大,表明 FA 對 NOB 的抑制作用越強。 反應結束時,NO -3 -N 和 NO -2 -N 共存,亞硝酸鹽累率分別達到 23. 65%和 55. 29% 。 由此表明反應過程中 FA 抑制了 NOB 的活性,導致了 NO -2 -N 積累。
綜上所述,4 組實驗結果呈現出相似的變化趨勢,隨著反應的進行,NH +4 -N 濃度逐漸降低、NO -2 -N度呈現先上升后下降的趨勢,NO -3 -N 濃度一直升高。 結果表明在一定氨氮底物濃度和溫度條件下,pH越高,FA 濃度越大,對 NOB 的抑制作用越強,反應結束時亞硝酸鹽積累率越高。 這與 CIUDAD 等、王瑩等的研究結果相符。
2. 3 硝化細菌濃度對氨氮氧化速率的影響
采用提高污泥濃度的方式進一步提高反應器內硝化細菌濃度,初始 DO 濃度均控制為 2. 5 mg·L - 1左右以排除低溶解氧導致氨氮氧化速率降低。 結果如圖 3 所示,污泥濃度提高 1 倍,氨氮氧化速率顯著提高,氨氮氧化完成的時間由150 min 縮短至105 min,反應時間縮短45 min,用時為6 L 的70% ,第1 小時的氨氮氧化速率由 36. 52 mg·( L·h) - 1提高至 56. 93 mg·( L·h) - 1。 由此表明硝化細菌濃度提高,反應速率加快,氨氮氧化完成時間提前。 而鄭敏等通過小試實驗同樣得出,通過向反應器內投加包埋硝化細菌填料和附著生物膜填料,以人工強化方式增加硝化細菌數量,氨氮去除效果均優于未投加填料的活性污泥系統,并且采用提高 MLVSS 的方式可以強化氨氮氧化速率的結論。
此外,如圖 3 所示,有效容積 6 L 時,NO -2 -N 峰值出現較晚,90 min 時才出現最高值 27. 58 mg·L - 1;而 3 L 時,NO -2 -N 峰值出現時間較早,45 min 時即達到 25. 68 mg·L - 1。 表明提高硝化細菌濃度,NO -2 -N氧化為 NO -3 -N 的速率加快,因此氨氮氧化完成時基本無 NO -2 -N 積累。
2. 4 FISH 分析
采用 FISH 技術分析篩選和富集培養后活性污泥中 AOB 和 NOB 在總細菌中的數量比例結果如圖4 所示。 根據面積比例計算平均值,統計獲得 AOB 和 NOB 分別約占細菌總數的 35% 和 42% ( Ni-trobacter:40% ,Nitrospira:2% ) ,表明系統以適宜硝化細菌生長的參數運行,可以實現硝化細菌菌群的篩選和富集,獲得以 AOB 和 NOB 占有絕對數量優勢的高純度硝化細菌菌群,從而實現系統內活性污泥的種群優化。具體參見污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關技術文檔。
3 結論
1)采用適宜 AOB 和 NOB 共同生長的反應條件可以成功篩選和富集高純度硝化細菌菌群,保留接種污泥中硝化細菌的菌群組成,同時實現高氨氮氧化速率。
2)在一定氨氮底物濃度和溫度條件下,提高 pH 值則 FA 升高,利于實現短程硝化,亞硝酸鹽積累率與FA 水平呈正相關,此外在適當范圍內提高 pH 值有助于提高氨氮氧化速率。
3)反應體系內較高的硝化細菌濃度是實現高氨氮氧化速率的重要物質基礎。
