潛流濕地是一種人工構建的高效污水凈化濕地，它利用物理、 化學、 生物三重協同作用處理污水，具有顯著的環境、 生態和經濟效益[1, 2]. 目前，已廣泛應用于生活污水、 垃圾滲濾液、 養殖廢水等處理[3, 4]. 濕地中的植物根系可以深入到表層以下0.6-0.7 m的基質層中，并與基質形成透水的交織網絡，攔截和吸附分解污水中的COD和氮磷等物質[5]. 有研究表明，在潛流濕地處理污水系統中，污水中70%的氮通過微生物作用去除[6]，其中厭氧氨氧化菌在濕地氮循環中有重要的作用，潛流濕地系統中ANAMMOX菌群對污水中氮的去除率占到總去除率的24%[7]. 相關研究認為，ANAMMOX廣泛存在于海洋、 河口、 海灣、 河流、 湖泊、 陸地和淡水濕地等生態系統之中[8]，ANAMMOX對區域海洋沉積物微生物氮循環的貢獻率為1.0%-67.0%[9, 10]，對河口和海灣沉積物微生物氮循環的貢獻率為1.0%-42.0%[11]，對河流和湖泊微生物氮循環的貢獻率最高可達40.0%-50.0%[12]. 另外，Long等[13]實驗表明ANAMMOX在土壤氮循環中的貢獻率達32.1%-77.9%. Zhu等[14]研究發現白洋淀濕地中ANAMMOX對微生物氮循環的貢獻率為2.4%-35.0%. 以上研究充分說明ANAMMOX在自然生態系統中的重要作用，但由于自然狀態下ANAMMOX菌生長緩慢，難以檢測，關于ANAMMOX菌的研究進展緩慢. 近年來，隨著16S rRNA分析和熒光原位雜交等技術的不斷發展，以16S rRNA、 hzo、 nirS、 hzs和細胞色素C等基因克隆文庫研究ANAMMOX菌的方法已經成熟[15]，ANAMMOX研究進入新階段. 水產養殖污水含有較高的氮磷等富營養化物質，對養殖環境的污染較大，采用人工濕地凈化養殖污水是近年新興起的技術，但由于相關研究較少，目前對人工濕地的凈化養殖污水的機理還了解不足，尤其是缺少針對濕地中ANAMMOX的研究. 為了解處理水產養殖排放污水潛流濕地中的厭氧氨氧化特征，本研究采用16S rRNA基因克隆文庫、 實時熒光定量PCR和多樣性分析等方法，探討了潛流濕地中ANAMMOX菌的菌群結構、 多樣性、 豐度特征，分析了提高潛流濕地的反硝化作用的方法，旨在為優化潛流濕地結構，提高潛流濕地凈化養殖污水效率提供理論依據.
1 材料與方法
1.1 潛流濕地
選擇中國水產科學研究院池塘生態工程研究中心(上海泖港，N30°57′1.89″，E121°08′52.21″)用于處理養殖排放水的潛流濕地作為研究對象. 該潛流濕地面積1 500 m2(寬40 m，長37.5 m)，基質采用3級碎石配級，基質厚度70 cm，底部鋪設0.5 mm HDPE 塑膠布做防滲處理. 潛流濕地的進、 出水區為長1.5 m、 粒徑50～80 mm的碎石過濾區，中間凈化區為長34.5 m的3層基質結構，其中底層基質厚度為30 cm、 粒徑50～80 mm的碎石層，中間基質為厚度30 cm、 粒徑20～50 mm的碎石層，上層基質為厚度10 cm、 粒徑10～20 mm碎石層，濕地的水力坡度0.5%～2%，孔隙率0.30～1.0. 濕地表面種植有美人蕉、 鳶尾、 菖蒲等植物，種植密度為每平方米4株. 潛流濕地結構如圖 1所示.
圖 1 濕地剖面示意
該潛流濕地于每年3月到11月的養殖期間運行，運行基本參數為：水體停留時間0.5～4 d，表面負荷率BOD 80～120 kg ·(hm2 ·d)-1.
1.2 樣品采集與處理
實驗于2014年3月1日開始至11月15日結束. 分別于春季(3月20日)、 夏季(6月20日)、 秋季(9月20日)在濕地進出水口的上、 中、 下層取基質樣.
采樣位置及數量：在潛流濕地的進水口(Wi)2-3 m處、 出水口(Wo)2-3 m處，上層(0-5 cm)、 中層(20-25 cm)、 下層(40-45 cm)采集基質樣，每次采集基質樣6個.
采樣及保存方法：基質樣采用人工挖掘到一定深度抽取泥水混合樣，取樣后立即裝入無菌塑封袋，排除空氣，密封，所有樣品用冰盒保存送至實驗室冷凍保存.
實驗室樣品處理：基質樣品分析測定前需進行預處理，處理方法為在500 mL無菌塑料廣口瓶中加入200 mL無菌水，放入半瓶基質樣品，使用180 r ·min-1搖床振蕩30 min，去除基質，然后將泥水混合物經3 000 r ·min-1離心10 min或經0.22 μm濾膜過濾后(泥土較少時)收集土壤，用于DNA提取.
1.3 DNA提取與PCR擴增
使用FastDNA SPIN Kit for Soil(美國Mpbio公司)試劑盒提取基質樣品(收集的土壤)中的DNA. DNA質量經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，共得到18個樣，分裝成2份，一份用于菌群結構、 多樣性的分析，一份用于定量分析.
將每個同批樣的6個DNA樣等量混合，采用巢式PCR對樣品中的ANAMMOX菌16S rRNA基因進行擴增. 第一輪采用引物對Pla46f-630r，第二輪采用引物對Amx368f-Amx820r，反應條件參照文獻[16]. PCR反應體系為Premix Ex Taq 12.5 μL; Forward primer 1 μL; Reverse primer 1 μL; 模板1 μL; ddH2O 9.5 μL.
1.4 文庫構建和測序
對巢式PCR擴增樣進行瓊脂糖凝膠電泳，然后采用特異片段切膠，經GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo)試劑盒純化后，用pEASY-T1 Cloning Kit(全式金)試劑盒連接，然后轉入Trans1-T1感受態細胞. 導入目的基因的感受態細胞經無氨芐LB培養基培養1 h后，涂布于含氨芐和藍白斑檢測試劑的固體LB平板上，經過夜培養后，每組樣品挑取20個單克隆. 采用菌落PCR進行陽性克隆檢測，選出18個陽性克隆接種于1 mL氨芐LB液體培養基中，在37℃搖床培養10 h，送上海Invitrogen公司測序.
1.5 菌落結構，多樣性分析
所得序列經DNAStar軟件編輯，去除載體序列后，采用Mothur軟件劃分操作分類單元(OTU). 選出每個OTU代表序列，用NCBI-BLAST工具比對，搜索相似序列并下載. 使用MEGA 5.05將相似序列與代表序列進行多重序列對齊，然后用鄰接(Neighbor-Joining)法構建系統發育樹. 用Mothur軟件計算菌落香農指數、 辛普森指數、物種豐富度和覆蓋率，對菌落多樣性進行分析.
1.6 實時熒光定量PCR與數據分析
分別用ANAMMOX菌16S rRNA的特異性引物AMX-808-F和AMX-1040-R對18個樣品中ANAMMOX菌的16S rRNA基因拷貝數進行定量，用細菌16S rRNA通用引物1055F-1392R對總微生物16S rRNA基因拷貝數進行定量. 采用的PCR儀器為 iCycler iQ5 (Bio-Rad，California，USA)，PCR 反應條件參照文獻[16].
2 結果與分析
2.1 潛流濕地中ANAMMOX菌群結構
對春季(3月20日)、 夏季(6月20日)、 秋季(9月20日)(圖表中分別用取樣月份Mar、 Jun、 Sep表示)樣品進行測序，共得到69條有效序列. 經Mothur 3%差異度劃分OTU，共得到6個OTU. 其中，Mar、 Jun、 Sep樣的OTU個數分別為3、 3、 4，表明潛流濕地中的ANAMMOX菌在不同季節中的OTU個數差異不大. 在所有OTU中，有2種OTU一直存在于潛流濕地中，為潛流濕地中ANAMMOX菌的優勢種. 其它OTU隨著時間變化而出現或消失，在Mar和Jun樣中分別發現一個該時期特有的OTU，在Sep樣中發現了2個該時期特有OTU，以上OTU與已知ANAMMOX菌16S rRNA基因比對顯示親緣關系較遠，可能是具有ANAMMOX作用的新菌種(圖 2).
圖 2 不同季節潛流濕地ANAMMOX菌群結構
采取系統發育分析方法對潛流濕地中獲得的ANAMMOX菌16S rRNA基因進行比對分析(圖 3). 發現潛流濕地中包含Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia兩類ANAMMOX菌. OTU 1#和OTU 2#與Candidatus brocadia fulgida的16S rRNA序列相似度分別高達98.2%-99.8%和97%-98.2%，屬于Candidatus brocadia屬，是潛流濕地中ANAMMOX菌的優勢種. 其中，OTU 1#與河北沙河中發現的ANAMMOX菌序列相似度達到98.4%-100%，OTU 2#與水稻田中發現的ANAMMOX菌序列相似度為97.7%-100%[17]. 在圖 3中，OTU 4#只存在于夏季Jun樣中，與Candidatus kuenenia的16S rRNA序列相似度高達98.4%-98.9%，屬于Candidatus kuenenia屬，與杭州西溪濕地的ANAMMOX菌序列相似度高達98.9%-99.8%，應該是該時期特有種類.
圖 3中，OTU 3#、 OTU 5#、 OTU 6#與目前已知的ANAMMOX菌16S rRNA序列相似度小于97%，為未知菌種. OTU 5#和OTU 6#為秋季Sep特有的兩個種類，與已知ANAMMOX菌的親緣關系較遠，其中OTU 5#與Candidatus kuenenia stuttgartiensis的16S rRNA序列相似度僅為93.4%-93.6%. OTU 6#雖與Candidatus brocadia caroliniensis的16S rRNA序列相似度為93.1%-93.4%，但與錢塘江發現的ANAMMOX菌基因序列相似度高達97.5%-98.4%. OTU 3#為春季Mar特有，與Candidatus anammoximicrobium的16S rRNA序列相似度僅為76.4%，但與菖蒲根際土壤中發現的一些基因序列的相似度高達99.5%.
圖 3 潛流濕地中ANAMMOX菌群序列與相似序列系統發育樹
2.2 潛流濕地ANAMMOX菌的多樣性
采用Mothur方法對潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性進行分析. 結果發現，潛流濕地中ANAMMOX菌16S rRNA基因的克隆覆蓋率超過95%(表 1)，表明本克隆文庫結果能較好地代表潛流濕地ANAMMOX菌的菌群多樣性水平. 從表 1中看出，不同季節ANAMMOX菌的香農多樣性指數(H′)在秋季Sep最高(H′，1.21)，春季Mar最低(H′,0.64)，說明隨著養殖時間延長和水體富營養化程度增大，潛流濕地中的ANAMMOX菌多樣性水平越來越高.
表 1 潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性水平
2.3 潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度
使用定量PCR法對不同季節的18個樣品進行分析. 結果表明，不同季節的樣品中均有ANAMMOX菌存在，其豐度(以鮮重計，下同)范圍在8.0×104-9.4×106 copies ·g-1之間，且多數樣品的豐度超過106 copies ·g-1. 在不同季節中，潛流濕地ANAMMOX菌的豐度差異較大，其中春季Mar出水口的下層最低，夏季Jun出水口的下層最大，二者差異超過102倍(圖 4).
Wi為進水口，Wo為出水口,下同 圖 4 不同季節不同層面厭氧氨氧化菌豐度對比
對不同季節潛流濕地不同層面中ANAMMOX菌的豐度分析發現，在潛流濕地的水平方向，春季Mar進水口的上、 中、 下層中ANAMMOX菌的豐度均高于出水口的上、 中、 下層. 夏季Jun出水口的上、 中、 下層中ANAMMOX菌的豐度均高于進水口的上、 中、 下. 秋季Sep則表現為進水口上層和下層中的ANAMMOX菌豐度低于出水口的上層和下層，進水口中層ANAMMOX菌的豐度顯著高于出水口中層(圖 4).
在潛流濕地的垂直方向，春季Mar和秋季Sep均呈現為濕地中間層ANAMMOX菌的豐度高于上、 下層，但夏季Jun的ANAMMOX菌豐度卻表現為下層>中層>上層(圖 5).
圖 5 不同季節厭氧氨氧化菌豐度垂直分布
以上結果表明，潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度存在明顯的空間差異，包括水平分布和垂直分布差異，但這種差異沒有隨時間變化的規律性(圖 4和圖 5).
2.4 潛流濕地中總細菌的豐度
對不同季節潛流濕地不同層面中的總細菌豐度進行了測定. 結果顯示，潛流濕地中總細菌的豐度在7.3×109-9.1×1010 copies ·g-1之間，最小值出現在春季Mar出水口的上層，最大值出現在夏季Jun出水口上層(圖 6). 分析顯示，不同季節潛流濕地不同層面中的總細菌豐度在時空上差異不明顯，潛流濕地中ANAMMOX菌占總細菌的比率范圍在0.74×10-5%-10.8×10-5%之間.
圖 6 不同季節不同層面總細菌豐度對比
3 討論
本研究通過巢式PCR技術在處理養殖排放水的潛流濕地中檢測出了2種已知和3類未知ANAMMOX菌. 其中Candidatus brocadia屬在潛流濕地中分布最廣，為處理養殖排放水潛流濕地中ANAMMOX菌的優勢種，與大多數淡水水域ANAMMOX菌優勢種一致[14, 18, 19]. 另據其他研究鄰近水域厭氧氨氧化的報道，在長江口、 西湖底質中檢測出Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia、 Candidatus scalindua 這3類ANAMMOX菌[11, 20]，在太湖底質中檢測出Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia、 Candidatus jettenia 這3類ANAMMOX菌[21]. 本實驗在潛流濕地中共檢測出Candidatus brocadia和Candidatus kuenenia 這2類已知ANAMMOX菌，雖然與附近水域相比種屬較少，但與白洋淀濕地和東江河完全一致[14, 22]. 在養殖期間的3個季節，潛流濕地中Candidatus brocadia屬一直都存在，說明是潛流濕地ANAMMOX菌的優勢種. 本實驗發現Candidatus kuenenia屬只出現在夏季，可能與該期間養殖水環境中的某些因子劇烈變化相關. 多數研究認為，鹽度是影響Scalindua屬分布的重要因子，但也有研究表明影響ANAMMOX菌種群的因素有很多，氮素、 碳氮比、 溫度等因素對ANAMMOX菌種群分布都有影響. 由于養殖排放水中的污染物以碳氮磷為主，關于碳氮磷等的比例、 組成等對ANAMMOX的影響作用研究還需進一步深入.
本研究發現處理養殖排放水的潛流濕地中ANAMMOX菌的香農多樣性指數在不同季節依次表現為秋季(Sep)>夏季(Jun)>春季(Mar)，說明潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性隨著養殖時間延長和養殖飼料投入增加而增高. 王謹[23]研究發現，秋季典型淡水養殖池塘中厭氧氨氧化細菌的多樣性比夏季更高，認為秋季是水產養殖飼料等投入最大的時期，也是水產養殖環境變化的高峰期，為適應外部環境，ANAMMOX菌可能表現出了更高的多樣性.
本研究發現處理養殖排放水潛流濕地ANAMMOX菌的豐度范圍在8.0×104-9.4×106 copies ·g-1之間，與淡水濕地生態系統中監測到的ANAMMOX菌豐度相當[24, 25, 26, 27]. 另外，Zhu等[16]在研究水稻土壤中ANAMMOX菌豐度垂直分布特征時發現，土壤深度為40-50 cm處的ANAMMOX菌豐度最高，與本研究發現的夏季(Jun)潛流濕地ANAMMOX菌的垂直分布特征一致. 不同的是處理養殖廢水潛流濕地表層(0-5 cm)的ANAMMOX菌豐度要低于中層(20-25 cm)，這與Zhu的研究結果相反，可能與潛流濕地相對較為疏松的基質結構有關. 總體看，夏季(Jun)潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度高于秋季(Sep)，但秋季(Sep) ANAMMOX菌的多樣性卻高于夏季(Jun). 前面分析認為ANAMMOX菌多樣性增高是適應外部環境的結果，雖然夏季(Jun)不是飼料等營養物投入的高峰期，但進入夏季后大量投入的富營養物可能會引起ANAMMOX菌的大量生長.
反硝化是潛流濕地的重要功能. 目前，在處理水產養殖污水的潛流濕地設計中一般只關注濕地的硝化反應和植物作用等，對濕地的反硝化作用重視不足. 鑒于ANAMMOX在濕地氮循環中具有重要的作用，提高濕地反硝化效果可以極大地提高濕地的凈化效率. 本研究發現不同季節潛流濕地ANAMMOX菌的多樣性和豐度差異巨大，這種現象除與養殖排放水的污染濃度不同外，可能還與濕地的結構以及布水方式有關，為了提高濕地的污水凈化效率，在夏秋季節適當縮短潛流濕地的水力停留時間或將傳統推流布水方式改為垂直流進水有可能會提高濕地的反硝化效果，另外采用多波段的濕地結構可能也是提高反硝化的重要方法. 總之，隨著對濕地反硝化研究的深入，將會為處理養殖排放水提供更高效的人工濕地技術.具體參見污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關技術文檔。
4 結論
(1)處理水產養殖污水的潛流濕地中存在Candidatus brocadia和Candidatus kuenenia兩類厭氧氨氧化菌和3類未知的ANAMMOX.
(2)處理水產養殖污水的潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性在不同季節存在差異，且多樣性隨著養殖時間延長而逐步增大.
(3)處理養殖排放水的潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度在水平分布和垂直分布上存在明顯差異，但無季節變化規律.（來源及作者：上海海洋大學水產與生命學院 曾憲磊 中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所 劉興國 吳宗凡 時旭 陸詩敏）
