1 引言
鉻鹽在制革工業中的有效利用率僅為60%左右，其余則以Cr3+的形式殘留在廢水和污泥中，并在環境和生物體內富集，從而嚴重影響生態環境可持續發展.同時，制革工業中還使用了許多表面活性劑，所使用的表面活性劑中，辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)的使用量最大.由于辛基酚聚氧乙烯醚具有難降解、疏水性、脂溶性和生物累積性等特點，大量使用產生了嚴重的環境污染.而在含Cr3+的制革廢水中，OPnEO等有機污染的存在使Cr3+在環境中的行為變得更為復雜，增加了廢水治理的難度.
目前，國內外對Cr3+和OPnEO的處理方法主要有物理吸附法、化學沉淀法以及生物處理法，其中生物法因來源廣泛、成本較低、無二次污染等特點備受關注.其中，生物處理法大多集中于針對單一污染物的去除，而實際要處理的對象為多種污染物組成的復合體系，以往針對單一污染物的研究成果應用到實際環境治理時會因為其它污染物的存在而達不到預期的效果，因此，對于研究微生物混合菌去除環境中的復合污染物更具有實際應用價值.
本論文以實驗室篩選保存的微紫青霉菌B5和醋酸鈣不動桿菌H1按不同比例配置成混合菌，開展混合菌同時去除Cr3+與OPnEO的實驗研究，獲得以1:1配制成的混合菌Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除效果最好，由此采用不同的固定載體對混合菌Z1進行包埋，研究影響固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO同步去除的主要環境因素，并對Cr3+和OPnEO的去除條件進行響應面法優化，從而確定固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO同步去除的最佳條件組合，研究結果為典型復合污染物的治理提供了新的思路和理論依據.
2 實驗材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.1 菌株來源
微紫青霉菌B5(Penicillium janthinellum);醋酸鈣不動桿菌H1(Acinetobacter calcoaceticus)，菌株B5和H1按照1:1配置成混合菌Z1.
2.1.2 培養基
LB培養基：酵母浸出物，5.0 g;胰蛋白胨，10.0 g;NaCl，10.0 g;TX-100(OPnEO，n=9~10)，1.0 g;蒸餾水定容至1000 mL;調節pH值至7.2;121 ℃滅菌20 min，備用(LB固體培養基在制備LB培養基過程中添加瓊脂粉15~20 g).
PDA培養基：葡萄糖，20 g;馬鈴薯，200 g(馬鈴薯去皮切塊，加去離子水煮沸10 min，過濾);一定量堿式硫酸鉻，蒸餾水定容至1000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min，備用.
無機鹽培養基(MS)：取K2HPO4，0.4 g;KH2PO4，0.4 g;NaCl，0.1 g;(NH4)2SO4，0.04 g;MgSO4·7H2O，0.1 g;MnSO4·H2O，0.01 g;Fe2(SO4)3·H2O，0.01 g;NaMoO4·2H2O，0.01 g;加水定容至1000 mL;121 ℃下滅菌20 min，備用.
2.1.3 主要實驗儀器
LRH-250-Z型恒溫振蕩培養箱;紫外可見分光光度計(上海);EASYpureⅡBarnstead ultrapure Water System，超純水凈化系統;J2-MC型冷凍離心機(美國BECKMAN公司);AGILENT 1100型高效液相色譜儀(美國);分離柱：ZORBAX Edipse XDB-C18.
2.1.4 實驗試劑
TX-100(OPnEO，n=9~10)，SIGMA試劑公司;十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS，TCI(上海)化成工業發展有限公司;改性秸稈載體，海藻酸鈉，聚乙二醇;堿式硫酸鉻，乙酸，其他試劑均為分析純.
2.2 試驗方法2.2.1 固定化載體的制備
海藻酸鈉固定化小球的制備;聚乙二醇固定化小球的制備;改性秸稈的制備.
2.2.2 Cr3+和OPnEO的同步去除試驗
在50 mL三角燒瓶中分別加入25 mL的OPnEO無機鹽液體培養基(OPnEO濃度為1000 mg·L-1)和25 mL的Cr3+(Cr3+濃度為1000 mg·L-1)無機鹽液體培養基，用1 mol·L-1的NaOH溶液調節pH至7.5，塞上棉塞，包扎后，121 ℃滅菌30 min.待培養基冷卻后，在無菌操作臺中對培養基進行編號標記，分別加入相同質量的固定化顆粒(20 g·L-1)，于28 ℃、搖床轉速為125 r·min-1的恒溫振蕩培養箱中培養48 h，每組設3個平行樣.
2.2.3 Cr3+和OPnEO同步去除率的計算
HPLC測定OPnEO的殘留量，二苯碳酰二肼法測定Cr3+的濃度.
(1)
式中，R為OPnEO的去除率;a為OPnEO初始濃度(mg·L-1);b為降解48 h后測定的OPnEO濃度(mg·L-1).
(2)
式中，Q為Cr3+的去除率;B為Cr3+初始濃度(mg·L-1);b為培養48 h后測定的Cr3+濃度(mg·L-1).
2.2.4 OPnEO標準曲線的制定及最佳固定化材料的選擇
稱取1.0 g OPnEO(TX-100，n=9~10)用色譜甲醇溶解，蒸餾水定容至100 mL，制成標準液保存備用.向系列10 mL容量瓶中分別加入0、0.02、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 mL OPnEO標準液，色譜甲醛稀釋至刻度，0.22 μm微濾膜過濾，用HPLC測定，得到OPnEO的標準曲線，與去除實驗測定的數據進行比對，根據比對結果確定最佳固定化材料.
2.2.5 響應面法優化固定化混合菌Z1的去除條件
選取pH值、溫度、時間、OPnEO初始濃度、Cr3+初始濃度、外加氮源等6個對固定化混合菌Z1去除Cr3+和OPnEO影響最明顯的因素，根據Placket-Burman實驗設計原理，對11個考察因素進行N=12的組合實驗，以Cr3+去除率為響應值，從中篩選出對固定化混合菌Z1去除 Cr3+影響最顯著的3個因素;再通過最陡爬坡實驗設計原理，以Box-Benhnken設計進行實驗，利用Design Expert軟件對實驗數據進行處理，得到固定化混合菌Z1去除Cr3+的最佳條件組合.
(1) Placket-Burman實驗設計
通過單因素實驗研究發現，菌株H1與B5具有較好的協同作用，對Cr3+和OPnEO的同步去除效果基本一致.根據Placket-Burman實驗設計原理，以Cr3+的去除率為響應值，采用N=12的組合實驗，研究對固定化混合菌Z1去除Cr3+和OPnEO產生影響的6個條件，從中篩選出對固定化混合菌Z1去除 Cr3+和OPnEO產生影響的3個最顯著因素(表 1).
(2) 最陡爬坡實驗
為更充分模擬真實情況，根據Placket-Burman設計結果，利用最陡爬坡實驗路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍，從而更加精確地接近最佳值區域.
(3) 響應面分析法確定固定化混合菌Z1的最佳去除條件
根據最陡爬坡實驗結果進行Box-Behnken設計，利用Design Expert 8.0軟件對實驗數據進行分析求得最優值，并繪制響應面分析圖.
表 1 Placket-Burman實驗設計因素及水平
3 結果與討論
3.1 固定化菌Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除結果
以聚乙二醇、改性秸稈、海藻酸鈉為固定化材料，得到固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除結果見表 2和圖 1.
表 2 不同固定化材料固定混合菌Z1對Cr3+的去除結果
從表 2和圖 1可知，分別以聚乙二醇、改性秸稈、海藻酸鈉為載體固定混合菌Z1對OPnEO的去除率為53.926%、46.99%、55.145%，而對Cr3+的去除率分別達到58.4%、54.2%、60.9%，所以在3種固定化材料中，以海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO同步去除效果最好.關向杰等在研究中發現游離狀態下菌株H1對OPnEO的降解率為50%左右;而黃水娥等在研究中發現，當培養基中的Cr3+濃度高于1000 mg·L-1時，在游離狀態下菌株B5對Cr3+的去除率低于50%，因此，選用海藻酸鈉為混合菌Z1的固定化載體.
圖 1 不同固定化材料固定混合菌Z1去除OPnEO的液相色譜圖(注：a表示以聚乙二醇為固定化材料，b表示以改性秸稈為固定化材料，c表示以海藻酸鈉為固定化材料)
3.2 海藻酸鈉固定化混合菌Z1去除 Cr3+的條件優化3.2.1 環境因素對海藻酸鈉固定化混合菌Z1同步去除 Cr3+和OPnEO的影響
單因素實驗得出，當pH值為7時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達到最大值62.7%和58.1%;當OPnEO初始濃度為950 mg·L-1時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達到最大值63.1%和58.9%;當溫度為30℃時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達到最大值64.6%和59.3%;當去除時間達到7 d后，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率在68.3%和73.5%左右，后期增長放緩;當Cr3+初始濃度為900 mg·L-1時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達到最大值70.14%和75.36%.外加氮源胰蛋白胨對Z1同步去除Cr3+和OPnEO的促進效果最大，去除率分別達到70.36%和76.51%，實驗同時還發現，外加有機氮源對Z1同步去除Cr3+和OPnEO有促進作用，無機氮源反而產生了抑制作用.
3.2.2 固定化混合菌Z1去除Cr3+的Placket-Burman實驗結果與分析
海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO的去除具有一定的協同作用(表 3)，在以往的研究中對于生物作用去除 Cr3+的研究相對較少，且Cr3+的污染危害更大，所以以Cr3+的去除率作為響應值更有意義，由此在后續的響應面優化去除條件過程中以Cr3+作為響應值.利用Design Expert8.0軟件對數據進行處理，Placket-Burman實驗結果如表 3所示.
表 3 響應值為Cr3+去除率條件下的Placket-Burman實驗結果
從表 3可知，實驗組7中Cr3+的去除率最高，達到71.42%;實驗組1中Cr3+的去除率最低僅為44.21%.運用SPPS 19.1軟件進行擬合，得到方程Y=73.37-9.16X1+6.35X2-2.15X3+0.37X4-3.37X5+21.33X6.
式中，X1表示pH值;X2表示溫度;X3表示OPnEO;X4表示胰蛋白胨濃度;X5表示去除時間;X6表示Cr3+初始濃度.
運用Design Expert 8.0軟件分析得到模型的P值為0.0177，表明該回歸方程較顯著，在研究區域內具有良好的擬合性.表 3和表 4的結果表明Cr3+濃度、pH值和溫度對Z1去除Cr3+的效果影響較大.確定初始Cr3+濃度、pH值與溫度為影響Z1對Cr3+去除率的關鍵因素.
表 4 響應值為Cr3+去除率條件下的Placket-Burman結果分析
3.2.3 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最陡爬坡實驗設計及結果
初始OPnEO濃度950 mg·L-1、胰蛋白胨添加量為6%、培養時間為7 d，隨著初始pH和溫度的增加及Cr3+濃度的減小，Z1對Cr3+的去除率出現先增大后減小.當初始pH值為7.5，Cr3+濃度為900 mg·L-1，溫度為30 ℃時，Z1對Cr3+的去除率達到最大值.由此可知，最大響應值區域為編號3實驗組，以這一組為中心點進行響應面分析，得到Z1去除Cr3+的最陡爬坡實驗設計結果(表 5).
表 5 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最陡爬坡實驗設計及結果
3.2.4 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最陡爬坡實驗結果與分析
以Cr3+濃度、pH值和溫度2個因子為自變量，以Z1對Cr3+的去除率為響應值，設計3因素3水平響應面分析試驗(表 6).運用Design Expert 8.0軟件對相關響應面值進行回歸分析處理，得到二次多項式方程： Cr3+去除率=74.02-3.50A-12.52B-2.59C-2.19AB-0.018AC+3.41BC-13.47A2-11.76B2-13.21C2
表 6 固定化混合菌Z1去除Cr3+的Box-Behnken 實驗設計及結果
式中，Y為Z1對Cr3+的去除率;A、B、C分別表示初始pH值、Cr3+濃度、溫度.系數R2=0.9612，表明方程具有良好的擬合度，可對試驗結果進行預測.
Box-Behnken 實驗回歸分析結果如表 7所示，根據表 7可知，p<0.0001，說明該模型顯著.結合圖 2，可更直觀的看出，各因素之間具有交互作用，且各因素對固定化混合菌Z1去除Cr3+效率的影響不是簡單的線性關系，對響應值的影響存在1極值點.
表 7 固定化混合菌Z1去除Cr3+的 Box-Behnken實驗回歸分析結果
圖 2 固定化混合菌Z1去除Cr3+的各影響因素及其交互作用的響應面
3.2.5 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最佳條件
根據表 7方差分析數據可知，固定化混合菌Z1對Cr3+的去除率影響因素大小的排序為：Cr3+濃度(B)﹥pH值(A)﹥溫度(C).通過Box-Behnken軟件得出A=7.64，B=856.34，C=30.39，即：初始pH 7.64、Cr3+濃度856.34 mg·L-1、溫度30.39 ℃.此時，固定化混合菌Z1對Cr3+去除率的最大預測值為77.83%.
3.3 驗證實驗
按照優化后的固定化混合菌Z1對Cr3+去除條件(初始pH 7.64、Cr3+濃度856.34 mg·L-1、OPnEO初始濃度為950 mg·L-1、溫度30.39 ℃、外加2 mL胰蛋白胨條件下培養7 d)進行3組平行實驗，實際檢測Z1對Cr3+的去除率達到77.69%，實驗值與預測值之間具有良好的擬合性，表明回歸方程能夠比較真實的預測各因素對海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+去除的影響.將實驗結果與單因素實驗條件下未進行響應面法優化的實驗結果進行比較，發現響應面法優化有利于海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+的去除，去除率提高了7%，這說明響應面法能有效預測并優化固定化混合菌Z1對目標化合物的降解.同時，在Cr3+的最佳去除條件下對海藻酸鈉固定混合菌Z1去除OPnEO的結果進行檢測，得到OPnEO的去除率為76.68%，提高了1%左右，該結果進一步說明了海藻酸鈉固定化混合菌Z1同步去除Cr3+和OPnEO過程中具有一定的協同作用，Shen等在其研究中也證實了這一點.具體參見污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關技術文檔。
4 結論
1) 以聚乙二醇、改性秸稈、海藻酸鈉3種材料為載體固定混合菌Z1，在搖床轉速125 r·min-1，28 ℃培養48 h，Z1對OPnEO的去除率分別為53.926%、46.99%、55.145%，而Z1對Cr3+的去除率分別達到58.4%、54.2%、60.9%.所以在3種固定化載體材料中，以海藻酸鈉為載體固定混合菌Z1對OPnEO和Cr3+的同步去除效果最好.
2) 通過單因素實驗確定pH 7.0、溫度30 ℃、OPnEO初始濃度950 mg·L-1、Cr3+初始濃度900 mg·L-1為固定化混合菌在Z1對Cr3+和OPnEO同步去除的最佳條件，外加胰蛋白胨對海藻酸鈉固定混合菌Z1同步去除Cr3+和OPnEO的促進效果最明顯.
3) 通過響應面法優化實驗，確定海藻酸鈉固定混合菌Z1在初始pH 7.64、Cr3+濃度856.34 mg·L-1、溫度30.39 ℃、OPnEO初始濃度為950 mg·L-1、外加2 mL胰蛋白胨條件下培養7 d，固定化混合菌Z1對Cr3+的去除率達到77.69%，比單因素實驗條件下固定化混合菌Z1對Cr3+的去除率提高了7%.
