1 引言

　　多氯聯(lián)苯已被確定為“三致”物質(zhì)，具有難降解性、生物毒性、生物蓄積性和遠距離遷移性等，對人類生存繁衍和可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅.我國已禁止多氯聯(lián)苯的生產(chǎn)和使用，但早期使用及處置較為粗放，某些特定地區(qū)依然存在較為嚴重的土壤PCBs污染.

　　用生物處理法修復(fù)PCBs污染土壤操作簡便、修復(fù)費用低，可徹底降解污染物，且不會產(chǎn)生二次污染.有研究報道，用Sinorhizobium meliloti菌株降解三氯聯(lián)苯2，4，4′-TCB，6 d降解率達到77.4%(Tu et al., 2011);用Stenotrophomonas maltophilia菌株降解四氯聯(lián)苯PCB52，7 d的降解率可達52.9%.但在受到PCBs污染的土壤中，常常有重金屬污染同時存在，重金屬對微生物降解PCB的生化過程有抑制作用.

　　本研究通過土著微生物篩選馴化，研究其對四氯聯(lián)苯PCB77降解能力及影響因素，并分析其受重金屬脅迫下的降解效率.

　　2 材料與方法

　　2.1 研究對象與菌株篩選

　　本文選擇四氯聯(lián)苯PCB77為研究對象，其化學(xué)名為3，3′，4，4′-Tetrachlorobiphenyl，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1.采用富集分離的培養(yǎng)方式，從長期受有機物污染的土壤中篩選獲得1株能以PCB77為唯一碳源生長、具有較寬泛環(huán)境適應(yīng)能力及較高降解效率的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas sp.)，命名為JXJ.利用聯(lián)苯為底物馴化其降解PCB77的能力，并對其生長和不同條件下降解PCB77特性研究.

　　圖1 PCB77化學(xué)結(jié)構(gòu)式

　　2.1 主要儀器及試劑

　　實驗所用標準品為PCB77(3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯)(美國Accust and ard);正己烷為色譜純級，其余試劑均為分析純.主要涉及儀器有氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國安捷倫)，智能精密搖床(上海博訊)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊)、潔凈工作臺(上海博訊)及滅菌鍋(上海三申)等.

　　2.2 主要溶液及培養(yǎng)基

　　土壤初步馴化營養(yǎng)液由5 g葡萄糖、1 g磷酸二氫鉀、2 g尿素、10 g聯(lián)苯和10 L蒸餾水配制.

　　用5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g NaCl、1000 mL蒸餾水，在pH=7.0條件下配制富集培養(yǎng)基;固體培養(yǎng)基再加入15 g · L-1的瓊脂，121 ℃滅菌30 min備用.

　　用0.5 g磷酸氫二鉀、0.5 g磷酸二氫鉀、1.0 g硫酸銨、0.2 g硫酸鎂、0.1 g氯化鈣、0.2 g氯化鈉、1000 mL蒸餾水，在pH=7.0條件下配制無機鹽培養(yǎng)基(MSM);固體培養(yǎng)基再加15 g · L-1的瓊脂，121 ℃滅菌30 min備用.

　　2.3 多氯聯(lián)苯降解菌的篩選及鑒定馴化

　　2.3.1 降解菌初步馴化、分離

　　采用規(guī)格為30 cm×30 cm ×20 cm的自制有機玻璃盒作為初步馴化裝置，底層鋪有高度約為2 cm的沙層，沙層上鋪2 cm礫石，礫石層上鋪有約8 cm取自某化工廠的有機污染土壤.定期加入含有聯(lián)苯濃度為1000 mg · L-1的初步馴化營養(yǎng)液，定期翻動土壤，保持一定的土壤濕度，并控制土壤pH值在6.5～7.5之間，馴化1個月.取上述初步馴化過的土壤1 g，50 mL滅菌液體富集培養(yǎng)基，裝入100 mL的三角瓶中，在30 ℃、150 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng).待培養(yǎng)液發(fā)生渾濁時，在富集培養(yǎng)基上劃線分離出單菌落.

　　2.3.2 降解菌強化馴化、分離

　　挑取上述分離出的單菌落，50 mL含有一定濃度PCB77的滅菌MSM，裝入100 mL的三角瓶中，在30 ℃、150 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每5～7 d轉(zhuǎn)接1次，在相同條件下進行傳代培養(yǎng)2個月，并不斷提高MSM中的PCB77的濃度，馴化菌株對PCB77的降解能力.取馴化培養(yǎng)得到的菌懸液，在固體MSM上劃線分離純化，篩選出對PCB77有較高降解能力的菌株，將該降解菌株保存于試管斜面上，4 ℃冷藏保存.

　　2.3.3 降解菌鑒定及理化性質(zhì)測定

　　菌株測序委托上海生物工程有限公司完成，得到該細菌的16S rDNA序列.登陸Genbank，通過Blast數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，利用MEGA5.0軟件，選用鄰接法(Neighbor Joining)，繪制該細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹.參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》和相關(guān)文獻進行形態(tài)和生理生化鑒定.

　　2.3.4 菌株的生長曲線測定

　　將純化后的菌株分別接種在液體富集培養(yǎng)基、含有1000 mg · L-1聯(lián)苯的MSM、含有1 mg · L-1 PCB77的MSM中，于30 ℃和150 r · min-1條件下培養(yǎng)，間隔一定時間取2 mL培養(yǎng)液，采用紫外-可見分光光度計(UVmini-1240，SHIMADZU)測定其在600 nm處的吸光度值，以此來表征培養(yǎng)液中菌體濃度.

　　2.4 高效降解菌降解率影響因素實驗

　　2.4.1 菌液的制備

　　將馴化分離出的菌株接種于富集培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以3500 r · min-1離心10 min，棄去上清液，用pH7.2的磷酸緩沖溶液洗滌沉淀物3次，重懸于相同培養(yǎng)基中，使最終OD600值約為1.0.

　　2.4.2 外加碳源對PCB77降解的影響

　　分別選取苯甲酸、鄰苯二甲酸、聯(lián)苯作為外加降解碳源.降解體系為裝有20 mL MSM的50 mL三角瓶，其中PCB77濃度為均1 mg · L-1.第1組為對照，第2組為1000 mg · L-1的聯(lián)苯，第3組為1000 mg · L-1的苯甲酸，第4組為1000 mg · L-1的鄰苯二甲酸.在30 ℃、150 r · min-1條件下培養(yǎng)7 d，取樣測定降解率.

　　2.4.3 體系pH對PCB77降解的影響

　　調(diào)節(jié)MSM的pH值，分別為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9，接入2 mL(OD600=1.0)降解菌液，控制降解體系中PCB77濃度為1 mg · L-1，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養(yǎng)7 d，取樣測定降解率.

　　2.4.4 PCB77初始濃度對降解的影響

　　在無菌條件下，準確移取一定量的PCB77母液于50 mL三角瓶中，待正己烷揮發(fā)完全后，加入滅菌的MSM，并接入2 mL的菌懸液，使降解體系中PCB77的濃度分別為0、0.5、1.0、3.0、5.0 mg · L-1，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養(yǎng)7 d，取樣測定降解率.

　　2.4.5 微生物接種量對PCB77降解的影響

　　在無菌條件下，用移液槍分別移取0.5、1.0、2.0、4.0 mL菌懸液于MSM中，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養(yǎng)7 d，取樣測定降解率，確定最適接種量.

　　2.4.6 重金屬對菌體降解PCB77的影響

　　用鉻和鉛作為外加重金屬，研究其對菌株降解PCB77的影響.在無菌條件下，準確移取2 mL濃度為10 mg · L-1的PCB77母液于50 mL三角瓶中，待正己烷揮發(fā)完全后，添加一定量的重金屬，并且接種菌液2 mL，使降解體系中重金屬濃度分別為0 mg · L-1、0.1 mg · L-1、1 mg · L-1、5mg · L-1、10 mg · L-1、20 mg · L-1，PCB77濃度均為1 mg · L-1.在30 ℃、150 r · min-1的搖床上培養(yǎng)7 d，取樣測定降解率.

　　以上降解率均指測定生長細胞對PCB77的降解率，接種2 mL對數(shù)生長期的菌懸液到20 mL不同降解體系中，測定7 d的降解率.每組實驗設(shè)定3組平行，并計算誤差.

　　2.4.7 PCB77的提取及測定方法

　　取20 mL正己烷加入降解體系中，超聲輔助萃取10 min(王炳玲，2014)，轉(zhuǎn)移混合液至分液漏斗中，待充分混合靜置分層后，將上下相分離，萃取3次.合并3次萃取得到的正己烷，經(jīng)無水硫酸鈉脫水處理后旋蒸至3～5 mL，氮吹近干，定容至5 mL，漩渦震蕩充分混合后，采用GC-MS測定，分析條件為30 m × 0.25 mm HP-5MS色譜柱，程序升溫，離子源溫度230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，不分流進樣，進樣量1 μL(史永富等，2014).

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 高效降解菌的生物學(xué)特性研究

　　3.1.1 菌株形態(tài)觀察

　　通過富集、馴化培養(yǎng)的方法，從長期受有機污染的土壤中分離出1株多氯聯(lián)苯降解菌，該菌株能以PCB77為唯一碳源進行生長，并對PCB77具有較高的降解能力.

　　觀察可知，該菌株在無機鹽固體平板培養(yǎng)基上具有以下特點：細胞呈圓形，直徑約1 mm，不透明，菌落小，細胞表面光滑，邊緣規(guī)則，接種初期為淺黃色，培養(yǎng)后產(chǎn)生綠色分泌物.在液體篩選培養(yǎng)基上有以下特點：整個培養(yǎng)液呈渾濁狀，隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)液顏色由透明的淡黃色，轉(zhuǎn)變成綠色并變渾濁，最后變成棕紅色.在光學(xué)顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)呈短桿狀，經(jīng)革蘭氏染色，判斷為陰性菌.

　　3.1.2 菌株生理生化指標測定

　　對JXJ菌株進行生理生化實驗，結(jié)果見表 1.

　　表1 菌株JXJ部分生理生化測定結(jié)果

　　3.1.3 多氯聯(lián)苯降解菌的鑒定

　　菌株的16S rDNA委托上海生工測定，獲得的測序結(jié)果利用GenBank中的Blast軟件進行序列相似性比較，結(jié)果顯示菌株JXJ的16S rDNA序列與多種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有高度相似性，相似度達99%.在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找并下載與JXJ菌株基因有較高相似性菌種的16S rDNA片段，使用MEGA5.0軟件，繪制JXJ菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹.從圖 2可以初步判斷，JXJ屬于銅綠假單胞菌屬.

　　圖2 降解菌株JXJ的系統(tǒng)發(fā)育樹

　　3.2 不同培養(yǎng)條件對菌株JXJ生長及降解PCB77的影響 3.2.1 菌株JXJ生長曲線

　　菌株JXJ在不同培養(yǎng)基中的生長情況如圖 3所示.從圖中可見，在相同培養(yǎng)條件下(30 ℃，150 r · min-1)，JXJ菌在富集培養(yǎng)基中長勢最好，24 h達到對數(shù)生長期，此后微生物量略有下降，并保持相對穩(wěn)定.由于聯(lián)苯和PCB77都有一定生物毒性，在含有聯(lián)苯和PCB77的MSM中，JXJ菌在不利的環(huán)境條件下，調(diào)整期明顯延長(栗冬梅等，2012).經(jīng)過約85 h后，JXJ菌快速生長，生長速率明顯上升.

　　圖3 不同培養(yǎng)基下菌株JXJ的生長曲線

　　3.2.2 外加碳源對PCB77降解率的影響

　　考察JXJ菌在3種不同外加碳源條件下，對濃度為1 mg · L-1的PCB77降解率的影響.如圖 4所示，聯(lián)苯和鄰苯二甲酸的添加提高了JXJ菌對PCB77的降解率，而苯甲酸的加入對降解有一定的限制作用，其中聯(lián)苯對降解促進作用最明顯，7 d降解率達到了58.5%，其次是鄰苯二甲酸，7 d降解率為53.8%，此時微生物利用外加的碳源，通過共代謝途徑，提高了降解效率(李方卉等，2014).苯甲酸的加入，對JXJ菌降解PCB77有一定的限制作用，可能與苯甲酸在水溶液中呈酸性，改變了體系pH條件，使得JXJ菌不能處于最佳生長環(huán)境有關(guān).實驗結(jié)果運用單因素方差分析，在0.05的置信水平上，不同組間有顯著差異，認為外加碳源的種類對微生物降解PCB77有顯著影響.

　　圖4 外加碳源對PCB77降解的影響

　　3.2.3 溫度、pH對PCB77降解率的影響

　　不同種類的微生物，最適宜生長的pH、溫度條件各不相同.培養(yǎng)體系pH的不同，會改變營養(yǎng)物質(zhì)的生物可利用性和污染物的形態(tài)及生物毒性，從而影響微生物的活性，最終導(dǎo)致微生物生長速率和污染物降解速率的變化(熊士昌等，2012).從圖 5a中可以看出，JXJ菌株可在pH值6.5~8范圍內(nèi)較快的生長，降解率保持在較高的水平，且在pH值為7.5時，7 d降解率高達49.3%，可見JXJ菌株適宜在中性或中性稍偏堿的條件下生長，過酸和過堿的條件會對其降解效果產(chǎn)生副作用.

　　圖5 不同環(huán)境條件對PCB77降解的影響

　　微生物的生長，需要一定的環(huán)境溫度條件.溫度相對較低時，隨著溫度提升，微生物及其酶活性提高，降解率也隨之增大;超過微生物最適溫度后，溫度的升高會導(dǎo)致微生物活性下降，甚至死亡，PCB77的降解率呈現(xiàn)顯著下降.由圖 5b可知，培養(yǎng)溫度對JXJ菌株降解PCB77具有較為顯著的影響，菌株可在較寬泛的溫度區(qū)間降解PCB77，在25 ～ 40 ℃范圍內(nèi)均能保持較好的降解能力，其中最適溫度為30 ℃.

　　3.2.4 PCB77

　　初始濃度對降解的影響 圖 6所示為不同初始底物濃度對PCB77降解的影響.可以看出，初始底物濃度較小時，JXJ菌對PCB77有較高的7 d降解效率;當?shù)孜餄舛葟? mg · L-1升高到5 mg · L-1，相應(yīng)的降解率從49.3%下降到16.8%.這是由于高濃度的底物對微生物活性產(chǎn)生了抑制作用，影響到了酶促反應(yīng)的進行，限制了微生物對污染物的降解(Cao et al., 2011).另一方面，當?shù)孜餄舛葟? mg · L-1增加到2 mg · L-1時，降解量從9.86 μg提高到14.64 μg，因為低濃度時底物的生物毒性效應(yīng)不明顯，且底物濃度的增大，可提高底物被微生物利用的幾率，從而提高降解量.繼續(xù)增大底物濃度，PCB77的7 d降解量基本保持不變，這是因為碳源的增加對生物代謝的促進作用有限，且高濃度的底物對微生物活性有一定的限制作用.由此可以看出，微生物對PCB77有一定的降解能力，但通常較適用于低濃度污染，且降解過程較緩慢.

　　圖6 PCB77初始濃度對降解的影響

　　3.2.5 接種量對PCB77降解的影響

　　微生物的初始接種量能夠顯著影響菌體生長.隨著接菌量的增大，菌體可通過如種內(nèi)協(xié)同作用，加快適應(yīng)新環(huán)境，縮短調(diào)整期，利于菌體總量的增加，從而提高了微生物的降解效率.圖 7是接菌量對PCB77降解的影響，隨著接菌量的增大，降解體系中PCB77的殘留率隨之減小;接菌量為0.5 mL時，PCB77的7 d殘留率為72.0%，是接菌量為4 mL時的1.67倍.

　　圖7 微生物接種量對PCB77降解的影響

　　3.2.6 外加重金屬對PCB77降解的影響

　　在添加鉛和鉻這兩種污染土壤中常見的重金屬后，JXJ菌對PCB77的7 d降解率出現(xiàn)了明顯差異，在相同濃度條件下，重金屬鉻對JXJ菌的抑制作用明顯強于鉛(圖 8).外加重金屬濃度較低時，鉻和鉛對JXJ菌限制較小，JXJ菌依然能保持較高的7 d降解率，鉛濃度為0.01 mg · L-1時，沒有明顯限制作用，當外加重金屬濃度逐漸增加，JXJ菌降解率有大幅度下降.在鉻濃度10 mg · L-1時的降解率約為0.01 mg · L-1時的一半;而同樣條件下，外加鉛時，降解率依然能夠保持在原來降解率的68%左右.這是因為不同重金屬離子對細菌生長抑制的毒性大小可能與細胞壁的親和性有關(guān)，細菌細胞壁表面帶有的負電荷，對帶正電荷的金屬離子有親和作用，親和性越強對微生物毒性越大(王秀麗等，2003;Xu et al., 2014).由此可以看出，在不同重金屬存在時，其對JXJ菌的生長以及對污染物降解的影響是不同的，并且高濃度的重金屬對JXJ菌均有一定的限制作用，因此JXJ菌適宜在污染物和重金屬濃度較低的情況下，可用來降解污染物.具體參見污水寶商城資料或http://m.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖8 外加重金屬對PCB77降解的影響

　　4 結(jié)論

　　1)從長期受有機物污染的土壤中馴化、篩選到1株能夠以PCB77為唯一碳源生長的高效降解菌JXJ，革蘭氏染色鑒定為陰性菌，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為銅綠假單胞菌.

　　2)菌株JXJ在30 ℃，pH為7.5，微生物接種量為2 mL(OD600=1)菌液，PCB77初始濃度為1.0 mg · L-1時PCB77 7 d的降解率為49.6%.

　　3)在不同碳源條件下，菌株JXJ的降解能力不同，聯(lián)苯和鄰苯二甲酸為外加碳源時，對降解有促進作用，且聯(lián)苯效果優(yōu)于鄰苯二甲酸;外加相同濃度苯甲酸時，對JXJ的降解有一定限制作用.

　　4)菌株JXJ可耐受一定濃度的重金屬，在低濃度外加重金屬鉻和鉛的條件下，依然能保持較高的降解率，具有一定的實際修復(fù)應(yīng)用前景.在高濃度外加重金屬條件下，菌株生長受到明顯抑制，降解率有大幅度下降，且鉻較鉛對菌株JXJ有更加明顯的抑制作用.